Fe/Mn双金属掺杂的ZIF-8包裹壳聚糖酶，用于高效合成壳聚糖寡糖

《International Journal of Biological Macromolecules》：Fe/Mn bimetal-doped ZIF-8-encapsulated chitosanase for highly efficient synthesis of chitosan oligosaccharide

MOFs作为酶固定化平台在工业生物催化中潜力巨大，但需兼顾酶特性与MOF结构。本研究将Fe2?/Mn2?双金属离子掺杂的ZIF-8与工程化壳聚糖酶BCC1复合，通过SEM、FTIR和TGA表征证实结构完整，固定化酶活性保持97%，在4℃下储存14天活性仍达117%，循环14次后活性保持72%。该策略通过金属激活增强酶热稳定性与循环稳定性，为工业生物催化提供高效稳定固定化方案。

　　

作者：子翔宇、孙小龙、尹凤伟、高佳、黄杰、张颖颖、陈瑶、傅永倩

中国浙江省台州市台州大学生命科学学院生物质功能材料开发与应用重点实验室，邮编318000

摘要

金属有机框架（MOFs）为酶固定提供了一个有前景的平台，然而开发能够同时满足酶特性和MOF结构要求的定制策略仍然是一个挑战。在本研究中，我们使用壳聚糖酶BCC1作为模型酶，并将Fe²⁺/Mn²⁺离子引入ZIF-8中，构建了一种基于双金属MOF的固定系统（BCC1@Fe/Mn-ZIF-8）。通过扫描电子显微镜（SEM）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）和热重分析（TGA）等手段对复合材料进行了全面表征，证实了酶的成功固定及其结构完整性。固定后的酶保留了97%的初始活性，并在严苛的热、pH值和溶剂条件下表现出更高的稳定性。值得注意的是，BCC1@Fe/Mn-ZIF-8在4°C下储存14天后仍保持117%的活性，在经过14次重复使用后仍保留72%的活性，显示出优异的储存和重复使用性能。这种基于双金属MOF的策略为酶固定提供了一种稳健且高效的方法，在工业生物催化领域具有巨大潜力。

引言

壳聚糖寡糖（COS）是通过脱乙酰化和解聚从壳聚糖衍生而来的阳离子寡糖[1]。从结构上看，它们由2-20个葡萄糖胺和N-乙酰葡萄糖胺单元通过β-1,4-糖苷键连接而成。与壳聚糖相比，COS具有显著提高的水溶性、较低的分子量、更好的生物相容性和更高的生物利用度[[2], [3], [4]]。这些特性使其具有多种生物活性，包括抗菌、抗炎、抗癌、抗氧化和免疫调节作用。因此，COS在食品、医药、农业和医疗保健领域具有广泛应用前景[5]。聚合度（DP）对它们的生物活性起着关键作用，这突显了控制分子大小的重要性。目前的制备方法包括化学法、物理法和酶法[6]。其中，酶法因其环境友好性、温和的反应条件、高特异性和安全性而在工业应用中更受欢迎。特别是壳聚糖酶能够在温和条件下选择性地产生具有特定DP的COS，支持其在靶向功能应用中的使用[3,7]。 壳聚糖酶（EC 3.2.1.132）专门催化壳聚糖中的β-1,4-糖苷键断裂，生成COS混合物。作为糖苷水解酶（GH）超家族的成员，壳聚糖酶被分为七个家族：GH3、GH5、GH7、GH8、GH46、GH75和GH80[8]。通常，由于蛋白质折叠的热力学稳定性较低[9]，提高酶的热稳定性往往会牺牲其催化活性[10]，因为稳定突变可能会降低酶的效率。COS的酶法生产需要较长的催化时间，因此提高壳聚糖酶的热稳定性和催化效率对于工业应用至关重要[1,11]。目前，半理性设计仍是提高酶稳定性的主要策略，但这通常劳动强度大且难以扩大到工业规模。近年来，MOFs作为一种有前景的酶固定平台崭露头角，因为它们具有可调的孔径、较大的表面积、可功能化的表面以及易于合成[[12], [13], [14], [15]]。与半理性工程相比，基于MOF的固定方法能够更快地改善酶的活性、结构稳定性和重复使用性[[16], [17], [18], [19], [20], [21]]。然而，固定在MOF上有时会降低酶的活性。值得注意的是，许多壳聚糖酶在金属离子（如Mn²⁺、Mg²⁺、Fe²⁺和Ca²⁺存在下表现出更高的催化性能，这可能是由于涉及二硫键的构象调节[[22], [23], [24]]。因此，开发结合金属离子激活的合理MOF基策略可以扩展固定壳聚糖酶在工业生物催化中的应用范围。 在本研究中，我们利用Fe²⁺/Mn²⁺掺杂的ZIF-8固定了来自苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）的工程化壳聚糖酶BCC1。这种方法显著提高了酶的稳定性和重复使用性，同时没有损害其催化活性。这种基于金属掺杂MOF的固定策略为提高壳聚糖酶及其他工业相关酶的稳定性提供了宝贵的见解（图1）。

化学品

脱乙酰度为95%的壳聚糖购自中国台州的Golden-Shell Pharmaceutical Co., Ltd.。不同聚合度（DP）的COS标准品来自新加坡的Sigma-Aldrich Corp。六水合硝酸锌（Zn(NO₃)₂·6H₂O）和氨水（NH₃·H₂O）来自中国上海的Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd。2-甲基咪唑（2-MIM）、3-甲基-1,2,4-三唑（Htmz）和咪唑-2-甲醛（ICA）购自上海Aladdin

BCC1的表征

我们的研究小组对原本由苏云金芽孢杆菌分泌的壳聚糖酶进行了定向工程改造。工程化的BCC1在大肠杆菌（E. coli）中异源表达，重组酶表现出显著提高的催化效率。SDS-PAGE分析证实了其成功表达和纯化，显示出一个主要条带，分子量为45 kDa（图1a）。进一步在多种温度条件下评估了BCC1的酶活性

结论

本研究成功开发了一种双金属掺杂的ZIF-8复合材料，用于在温和的水性条件下原位封装壳聚糖酶（BCC1）。我们获得了高封装效率的BCC1@Fe/Mn-ZIF-8，其催化性能与游离酶相当，同时热稳定性和化学稳定性也得到了显著提高。固定后的酶在长时间储存和多次重复使用后仍保持高活性。与单金属MOFs相比，BCC1@Fe/Mn-ZIF-8表现出更好的性能

作者贡献声明

子翔宇：撰写初稿、方法学设计、数据整理、概念构思。 孙小龙：数据可视化、方法学设计、数据整理。 尹凤伟：数据分析、数据整理。 高佳：数据分析。 黄杰：数据可视化、验证。 张颖颖：资金筹集、数据整理、概念构思。 陈瑶：撰写、审稿与编辑、方法学设计。 傅永倩：撰写、审稿与编辑、监督、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本研究得到了浙江省自然科学青年基金（LQ21B060002）、浙江省自然科学基金（LTGD23C100001）以及台州市科技项目（23gya06）的支持。