CsBZR4-CsRBOH5.1-BR模块调控黄瓜子叶的开放/闭合及伸展过程

《International Journal of Biological Macromolecules》：CsBZR4-CsRBOH5.1-BR module regulates opening/closure and expansion of cucumber cotyledons

氢过氧化氢通过CsRBOH5.1-NADPH氧化酶调控黄瓜子叶开闭与扩张，形成CsBZR4- CsRBOH5.1-BR自强化反馈环路。突变体表型经外源H2O2和24-epibrassinolide（EBR）补充验证，分子机制证实EBR通过激活CsBZR4转录因子正向调控CsRBOH5.1表达，同时H2O2促进BR合成，阐明ROS信号与植物激素协同调控子叶发育的新机制。

　　植物的生长发育受到多种生理和环境因素的调控，其中氢过氧化物（H?O?）和油菜素内酯（Brassinosteroids, BR）在这一过程中扮演着重要角色。H?O?作为一种重要的活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS），不仅参与植物的信号转导，还在细胞伸长、形态建成等关键过程中发挥调控作用。而BR作为植物中一类重要的植物激素，对细胞伸长、器官形成以及植物的生长潜力具有深远影响。本文的研究揭示了H?O?与BR在植物子叶发育中的协同作用，特别是在子叶展开、闭合以及生长过程中，H?O?通过调控BR的合成，从而影响子叶的形态变化。这一发现不仅拓展了我们对植物中ROS调控机制的理解，也为植物器官发生过程中红ox信号与植物激素信号之间的整合提供了新的视角。

子叶是植物最初的光合器官之一，其发育状态直接影响到幼苗的形成、生存和生长潜力。在黄瓜中，子叶的早期损伤会显著降低植物密度，减缓幼苗的生长速率，并可能影响最终的产量。此外，子叶在幼苗发育初期的去除会导致花序减少、开花延迟，对植物长期的生长表现产生重大影响。因此，研究子叶的发育机制对于提高黄瓜的产量和培育健壮的幼苗具有重要意义。在幼苗生长过程中，子叶的形态变化与环境信号密切相关，例如光照、温度和植物激素的调控。在黑暗条件下，幼苗会经历一种称为“黄化”的发育过程，表现为子叶闭合、胚轴伸长，形成类似钩状的结构。一旦幼苗暴露在光线下，子叶会迅速展开，同时抑制胚轴的生长，这一过程被称为“去黄化”，为幼苗的光自养生长做好准备。

在植物细胞中，ROS的生成和积累与多种生理过程相关，包括信号转导、细胞伸长、细胞分裂以及根系发育等。H2O2作为一种重要的ROS，其在细胞外空间（称为细胞壁外空间，即apoplast）的积累与植物对各种环境刺激的反应密切相关。例如，H2O2的产生受到机械损伤、化学变化、植物激素（如脱落酸）以及环境压力等因素的影响。研究发现，H2O2不仅在植物的抗逆反应中发挥作用，还在调控植物的生长发育中具有重要作用。例如，外源H2O2的应用可以打破马铃薯块茎和拟南芥种子的休眠状态，促进其萌发。此外，蛋白质组学分析表明，H2O2诱导的蛋白质在植物的信号转导、发育、细胞伸长和分裂等过程中具有功能关联。

BR作为一类重要的植物激素，广泛参与植物的生长和发育过程。它们不仅调控细胞伸长，还在维持分生组织活性、促进器官形成等方面发挥关键作用。研究发现，BR的合成与光照条件之间存在拮抗关系，光照能够促进BR的合成，从而影响子叶的展开和闭合。在拟南芥中，研究已经表明BR信号对于光形态建成过程中的钩状结构展开和叶柄发育至关重要。此外，BR还能够调节植物的抗逆反应，例如在干旱、盐碱等胁迫条件下，BR信号能够增强植物的耐受性。同时，H2O2在BR信号的调控中也起着重要作用，它不仅能够激活BR信号，还能够促进BR的合成。然而，H2O?如何具体调控子叶的展开和闭合，目前尚不清楚。

为了探究这一问题，本文首次在植物中发现，由CsRBOH5.1编码的NADPH氧化酶在调控子叶的展开、闭合和生长过程中发挥关键作用。CsRBOH5.1突变体表现出子叶运动异常和BR水平下降，特别是28-去甲油菜素和酪油菜素。通过外源H2O2和24-表油菜素（EBR）的处理，这些表型缺陷得到了显著改善。分子分析进一步揭示了H2O2对BR合成的促进作用，以及CsBZR4转录因子在这一过程中的关键调控作用。EBR能够上调CsBZR4的表达，而CsBZR4则直接结合并激活CsRBOH5.1的启动子，这一过程通过酵母单杂交和双荧光素酶实验得到了验证。这表明H2O2和BR之间存在一种自我强化的调控模块：CsRBOH5.1生成的H2O2促进BR的合成，而BR通过CsBZR4的转录激活进一步促进CsRBOH5.1的表达。这种反馈机制确保了子叶生长动态的精确调控，通过氧化代谢和BR合成的相互作用，协调红ox信号与植物激素信号之间的关系。

此外，研究还发现CsBZR4并不直接调控子叶的展开和闭合，而是通过调控CsRBOH5.1的表达间接影响这一过程。这一发现为理解植物中红ox信号与植物激素信号之间的相互作用提供了新的视角，也揭示了BR在调控子叶发育中的重要性。同时，该研究为植物器官发生过程中红ox生物学与激素调控的整合提供了新的理论依据。

在实验方法方面，本文使用了黄瓜（Cucumis sativus L.）的自交系Xintaimici作为实验材料，该材料由中科院蔬菜花卉研究所提供。研究中还利用了我们之前成功敲除的CsRBOH5.1突变体，这些突变体的命名来源于Di等人（2024）的研究。幼苗在特定的环境条件下生长，包括白天温度为25°C，夜间温度为18°C，光照周期为16小时白天和8小时黑夜。为了确定H2O2在子叶发育中的作用，研究首先检测了子叶在不同发育阶段的H2O2含量。结果显示，在子叶展开初期，H2O2的含量较高，而随着子叶的成熟，H2O2的含量逐渐降低。这一发现表明H2O2在子叶的早期形态建成中具有重要的功能意义。

为了进一步验证H2O2与BR之间的相互作用，研究进行了外源H2O2和EBR的处理实验。结果显示，这些处理能够显著改善CsRBOH5.1突变体的表型缺陷，表明H2O2和BR在子叶发育中具有协同作用。此外，研究还通过分子生物学方法，如酵母单杂交和双荧光素酶实验，验证了CsBZR4对CsRBOH5.1启动子的直接调控作用。这一发现表明，在植物中，H2O2和BR之间存在一种复杂的反馈机制，通过这种机制，植物能够精确调控子叶的生长动态，从而适应不同的环境条件。

在实验过程中，研究还采用了多种仪器和设备，包括液相色谱-串联质谱系统（LC-MS/MS）、离心机、分析天平、球磨机、氮气蒸发器、多管涡旋混合器、干燥箱和RT-PCR系统等。这些设备用于样品的提取、分离、定量和分析，确保实验数据的准确性和可靠性。此外，研究还使用了多种标准试剂和溶剂，包括EBR、H2O2、乙腈、4-DMAPBA、甲酸和乙醇等，这些试剂用于实验的各个步骤，包括样品处理、检测和分析。

在讨论部分，研究进一步探讨了H2O2在植物中的其他功能。例如，H2O2不仅参与子叶的展开和闭合，还在调控植物的顶端优势、光合作用和根尖生长等方面发挥重要作用。然而，其在子叶发育中的具体作用机制尚未完全阐明。本文的研究发现，H2O2在子叶的早期发育阶段具有较高的积累，这表明它在子叶的形态建成中起着关键作用。此外，H2O2的产生不仅局限于细胞外空间，还可能发生在多个亚细胞结构中，如线粒体、内质网和细胞质等。这表明H2O2的调控作用可能涉及多种细胞机制，而不仅仅是细胞外的反应。

研究还发现，BR的合成和积累与H2O2的调控密切相关。在拟南芥中，BR的合成受到光照条件的调控，光照能够促进BR的合成，从而影响子叶的展开和闭合。此外，BR还能够调控植物的抗逆反应，例如在干旱、盐碱等胁迫条件下，BR信号能够增强植物的耐受性。同时，H2O2在BR信号的调控中也起着重要作用，它不仅能够激活BR信号，还能够促进BR的合成。然而，H2O2如何具体调控BR的合成，目前尚不清楚。

本文的研究揭示了H2O2和BR之间存在一种复杂的反馈机制，通过这种机制，植物能够精确调控子叶的生长动态。这一发现不仅拓展了我们对植物中ROS调控机制的理解，也为植物器官发生过程中红ox信号与植物激素信号之间的整合提供了新的视角。此外，研究还发现，CsBZR4并不直接调控子叶的展开和闭合，而是通过调控CsRBOH5.1的表达间接影响这一过程。这一发现为理解植物中红ox信号与植物激素信号之间的相互作用提供了新的理论依据。

综上所述，本文的研究揭示了H2O2和BR在植物子叶发育中的协同作用，为植物生长发育的调控机制提供了新的见解。同时，该研究也为植物器官发生过程中红ox生物学与激素调控的整合提供了理论支持，为未来的植物发育研究提供了新的方向。这些发现不仅有助于提高黄瓜的产量和培育健壮的幼苗，也为其他作物的生长发育调控提供了参考。此外，该研究还为理解植物在不同环境条件下的适应机制提供了新的视角，为植物抗逆反应的研究提供了理论依据。