通过联合机械处理和温和氧化方法提取高纯度中链长度聚羟基烷酸酯

《International Journal of Biological Macromolecules》：Extraction of high-purity medium-chain-length polyhydroxyalkanoates via combined mechanical treatment and mild oxidation

CRISPR-Cas系统通过靶向tetM、ermB、VanA等耐药基因逆转多重耐药菌对抗生素敏感性，并探讨工程噬菌体、纳米颗粒等递送方法。

　　在21世纪，抗生素耐药性（AMR）已成为全球范围内最为严峻的公共卫生问题之一。尽管全球范围内投入了巨额资金用于研究和应对这一挑战，但抗生素耐药性依然持续存在，并对人类健康构成严重威胁。过去三十年间，因细菌耐药性导致的全球死亡人数从1990年的478万增加到2019年的494万，随后略有下降，至2021年为471万。2019年，估计有127万例死亡直接由抗生素耐药性导致，其中印度的死亡人数高达104万，占全球总数的近四分之一，约有29.7万例死亡与耐药性感染相关。预计到2050年，这一数字可能在全球范围内上升至每年1000万，在印度则可能达到200万。这一令人担忧的趋势主要源于抗生素的过度使用、不合理的处方模式、在农业中的广泛使用以及患者对治疗方案的依从性不足。

在抗生素耐药性问题中，多重耐药性（MDR）尤为突出，它是指细菌对多种抗生素类别表现出耐药性的现象。MDR感染不仅增加了治疗的复杂性，还显著降低了抗菌药物的有效性，给临床治疗带来了巨大挑战。为了应对这一问题，世界卫生组织（WHO）将ESKAPE病原体列为开发新抗菌药物和治疗干预措施的最高优先级病原体之一。ESKAPE病原体包括**粪肠球菌**（*Enterococcus faecium*）、**金黄色葡萄球菌**（*Staphylococcus aureus*）、**肺炎克雷伯菌**（*Klebsiella pneumoniae*）、**鲍曼不动杆菌**（*Acinetobacter baumannii*）、**铜绿假单胞菌**（*Pseudomonas aeruginosa*）以及**肠杆菌属**（*Enterobacter species*）。这些细菌是医院获得性感染的主要病原体，因其能够通过多种分子机制抵抗多种抗生素而臭名昭著。

在科学界，抗生素耐药性问题促使人们思考如何有效清除这些耐药性。自1928年亚历山大·弗莱明发现第一种抗生素——青霉素以来，1942年便记录了首个抗生素耐药性病例，即金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性。随着抗生素的广泛使用，耐药性问题愈发严重。近年来，研究者们积极探索新的策略和替代治疗方法，如单克隆抗体、纳米医学、抗菌肽（AMPs）、噬菌体疗法以及基因编辑工具CRISPR-Cas系统等。其中，CRISPR-Cas系统因其精准性和高效性，被认为是应对抗生素耐药性的重要手段之一。

CRISPR-Cas系统是原核生物适应性免疫系统的一部分，它使细菌能够获取并保留来自入侵者的遗传片段，从而在未来的感染中实现对特定DNA序列的识别和切割。这一机制不仅提供了免疫保护，还能精准识别并切割抗生素耐药基因。CRISPR-Cas系统主要包括多种技术，如CRISPR-Cas9、Cas3、dCas9和迷你CRISPR系统等，这些技术被广泛应用于ESKAPE病原体中，以消除耐药性基因，恢复细菌对传统抗生素的敏感性。

然而，尽管CRISPR-Cas技术展现出巨大的潜力，其在抗菌治疗中的应用仍面临诸多挑战和限制。例如，脱靶效应、CRISPR-Cas成分在细菌群体中的低效递送以及免疫原性等问题。为了克服这些关键障碍，研究者们开发了多种创新策略，包括利用纳米颗粒封装CRISPR成分，以增强其细胞摄取和稳定性；使用经过改造的噬菌体作为靶向递送工具；以及通过共轭质粒将CRISPR-Cas成分传递至细菌群体中。这些方法的探索为CRISPR-Cas系统的临床应用提供了新的思路。

噬菌体作为天然或经过工程改造的病毒，能够感染并选择性地杀死细菌。它们主要通过两种机制：裂解周期（针对致病性噬菌体）和溶源周期（针对温和噬菌体）。在裂解周期中，噬菌体识别细菌表面的特定受体，将其遗传物质注入宿主细胞内。随后，噬菌体利用宿主细胞的机制进行复制和蛋白质合成，最终导致细菌裂解和死亡。而在溶源周期中，噬菌体将其遗传物质整合到宿主细菌的基因组中，并保持休眠状态，直到受到特定刺激才被激活。相比溶源性噬菌体，裂解性噬菌体被认为更适合用于治疗应用，因为它能够直接杀死目标细菌，而不对其基因组造成长期改变。

在应对多重耐药性感染的挑战中，CRISPR-Cas系统和噬菌体疗法展现出了独特的潜力。例如，*P. aeruginosa*的外膜蛋白OprM作为一种外排泵，能够将多种抗生素排出细胞外，从而降低其在细胞内的浓度，导致抗生素耐药性。OMKO1是一种裂解性噬菌体，能够靶向OprM。面对噬菌体的攻击，*P. aeruginosa*会通过修改或完全丧失OprM来逃避感染。然而，这种改变会破坏外排系统，使抗生素在细胞内积累，从而提高细菌对抗生素的敏感性。这一现象表明，通过噬菌体和CRISPR-Cas系统相结合，可以有效地逆转细菌的耐药性，提高抗菌治疗的成功率。

此外，CRISPR-Cas系统在消除抗生素耐药性方面也取得了显著进展。例如，在*K. pneumoniae*中，原生的CRISPR-Cas3系统能够实现对耐药质粒的近100%清除，从而有效逆转药物耐药性。在*E. coli*中，一种共轭CRISPR-Cas9系统能够靶向*mcr-1*和*tet(X4)*基因，成功恢复细菌对多粘菌素和替加环素的敏感性，将耐药细菌的比例降至1%以下。这些案例展示了CRISPR-Cas系统在对抗多重耐药性方面的巨大潜力，也为未来的临床应用提供了重要的参考。

CRISPR-Cas系统的核心机制包括适应、表达和干扰三个阶段。适应阶段是指细菌通过CRISPR系统识别并记录外来遗传物质的序列，这些序列被插入到CRISPR基因座中，形成重复的序列间隔。表达阶段涉及CRISPR相关蛋白的合成，如Cas9、Cas3等，这些蛋白能够结合特定的引导RNA（gRNA）形成RNA-蛋白复合物。干扰阶段则是CRISPR-Cas系统对目标DNA进行切割的过程，通过精确的基因编辑，实现对耐药性基因的删除或失活。这一过程不仅能够有效消除细菌的耐药性，还能恢复其对传统抗生素的敏感性，从而提高抗菌治疗的效果。

在CRISPR-Cas系统的应用中，不同的技术具有各自的优势和特点。例如，CRISPR-Cas9因其高效的基因编辑能力而被广泛使用，而Cas3则能够直接切割DNA，适用于某些特定的耐药性基因。此外，dCas9（失活的Cas9）可以用于靶向调控而不进行DNA切割，为研究者提供了更多的调控手段。迷你CRISPR系统则能够简化基因编辑流程，提高递送效率。这些技术的多样性为应对不同类型的耐药性问题提供了更多可能性。

CRISPR-Cas系统的递送方式也经历了不断的创新和优化。传统的递送方法，如使用化学载体或物理方法，往往存在效率低、毒性高和稳定性差等问题。近年来，研究者们开发了多种新的递送策略，包括利用纳米颗粒、共轭质粒和天然噬菌体等手段。纳米颗粒能够封装CRISPR成分，提高其在体内的稳定性和靶向性。共轭质粒则能够通过细菌间的水平基因转移将CRISPR-Cas系统传递至目标细菌群体。天然噬菌体则因其特异性、感染能力和直接将核酸注入细菌细胞的能力，成为一种高效的递送工具。这些方法的探索不仅提高了CRISPR-Cas系统的应用效果，也为未来的临床治疗提供了更多选择。

在实际应用中，CRISPR-Cas系统与噬菌体疗法的结合展现出了独特的协同效应。例如，通过噬菌体将CRISPR-Cas系统递送至目标细菌，可以实现对耐药性基因的精准编辑，从而提高抗菌治疗的成功率。这种策略不仅能够有效消除细菌的耐药性，还能减少对传统抗生素的依赖，降低耐药性进一步发展的风险。此外，CRISPR-Cas系统还可以与其他抗菌策略相结合，如单克隆抗体、抗菌肽和纳米医学等，形成多管齐下的治疗方案，提高对抗多重耐药性感染的整体效果。

在应对多重耐药性感染的过程中，CRISPR-Cas系统展现出了巨大的潜力。它不仅能够精准识别并切割耐药性基因，还能通过基因编辑的方式恢复细菌对传统抗生素的敏感性。这种精准性使得CRISPR-Cas系统在抗菌治疗中具有独特的优势，能够有效解决传统抗生素难以应对的耐药性问题。同时，CRISPR-Cas系统还可以通过调控细菌的基因表达，实现对耐药性机制的抑制，从而降低细菌的生存能力。

为了进一步提高CRISPR-Cas系统的应用效果，研究者们正在探索更高效的递送方式和更精确的基因编辑策略。例如，利用工程改造的噬菌体作为递送载体，能够提高CRISPR-Cas系统的靶向性和递送效率。此外，通过优化引导RNA的设计，可以提高CRISPR-Cas系统的特异性，减少脱靶效应的发生。这些技术的不断进步为CRISPR-Cas系统在临床中的应用提供了更多可能性，也为未来的抗菌治疗开辟了新的道路。

CRISPR-Cas系统在对抗多重耐药性感染中的应用不仅限于直接消除耐药性基因，还包括通过调控细菌的基因表达来抑制耐药性机制。例如，某些细菌通过表达特定的基因来增强其对抗生素的抵抗力，而CRISPR-Cas系统可以通过靶向这些基因，实现对其表达的抑制，从而降低细菌的耐药性。这种策略不仅能够有效恢复细菌对传统抗生素的敏感性，还能减少耐药性进一步发展的风险。

此外，CRISPR-Cas系统还可以与其他抗菌策略相结合，形成综合性的治疗方案。例如，通过噬菌体疗法和CRISPR-Cas系统的结合，可以实现对耐药性细菌的精准清除，同时减少对正常菌群的破坏。这种综合治疗策略不仅能够提高抗菌治疗的效果，还能降低耐药性进一步发展的风险，为临床治疗提供更多的选择。

CRISPR-Cas系统的应用也面临一些挑战和限制。例如，脱靶效应可能导致对非目标基因的切割，从而引发不可预见的后果。此外，CRISPR-Cas成分在细菌群体中的递送效率仍然较低，需要进一步优化。为了克服这些问题，研究者们正在探索新的递送方式和基因编辑策略，如利用纳米颗粒提高CRISPR-Cas成分的稳定性，或通过工程改造的噬菌体提高其靶向性和递送效率。这些方法的探索为CRISPR-Cas系统的临床应用提供了更多可能性。

综上所述，CRISPR-Cas系统在对抗多重耐药性感染方面展现出了巨大的潜力。它不仅能够精准识别并切割耐药性基因，还能通过基因编辑的方式恢复细菌对传统抗生素的敏感性。同时，CRISPR-Cas系统还可以与其他抗菌策略相结合，形成综合性的治疗方案，提高抗菌治疗的效果。为了进一步提高其应用效果，研究者们正在探索更高效的递送方式和更精确的基因编辑策略，为未来的抗菌治疗开辟了新的道路。