古菌基因组中核糖核苷酸的全景图谱揭示RNase H介导的修复机制与复制起源特征

《Nucleic Acids Research》：Genome-wide ribonucleotide detection in Archaea

本研究针对古菌基因组中核糖核苷酸(rNMP)嵌入的检测与修复机制这一前沿问题，通过核糖核苷酸测序(ribose-seq)技术首次在两种古菌（Haloferax volcanii和Thermococcus barophilus）中实现了全基因组范围的rNMP定位。研究发现RNase HII是古菌中主要的rNMP修复酶，其缺失会导致rNMP大量积累；同时揭示了RNase HI和Fen1在备份修复途径中的作用，并首次利用rNMP分布模式成功识别了古菌复制起源(oriC)的链切换特征。该研究为理解古菌基因组稳定性维持机制提供了重要见解，对认识生命三域中rNMP代谢的进化具有重要意义。

　　

在生命演化的长河中，古菌作为生命三域之一，其独特的生物学特性一直吸引着科学家的关注。然而，与细菌和真核生物相比，我们对古菌基因组稳定性的维持机制了解甚少。DNA复制过程中，DNA聚合酶偶尔会"犯错误"，将核糖核苷酸(rNMP)掺入到DNA链中，而不是正确的脱氧核糖核苷酸(dNMP)。由于细胞中rNTP的浓度远高于dNTP，这种错误掺入时有发生。虽然一定数量的rNMP可能具有生理功能，但过多的rNMP积累会导致基因组不稳定，与多种人类疾病相关。

为了解决这一问题，细胞进化出了专门的修复机制，其中核糖核酸酶H(RNase H)发挥着关键作用。RNase H分为两种类型：RNase HI(在真核生物中为RNase H1)和RNase HII(在真核生物中为RNase H2)。RNase HII能够识别并切除单个嵌入的rNMP，启动核糖核苷酸切除修复(RER)途径；而RNase HI则需要至少四个连续的rNMP才能进行切割。在细菌和真核生物中，这些酶的功能已经得到较为充分的研究，但在古菌中，尤其是在全基因组范围内对rNMP分布和修复机制的理解仍然有限。

在这项发表于《Nucleic Acids Research》的研究中，Yann Moalic等科学家选择了两类代表性的古菌模型：来源于死海的嗜盐古菌Haloferax volcanii(Hvo)和来源于深海热液喷口的嗜压超嗜热古菌Thermococcus barophilus(Tba)。这两种古菌虽然同属于广古菌门(Euryarchaeota)，但生长条件和生活环境差异巨大，为研究古菌rNMP代谢的多样性提供了理想模型。

研究人员首先通过碱性水解实验直观展示了rNMP在基因组中的积累情况。结果显示，在RNase HII缺失的突变株中，DNA对碱性条件更为敏感，表明rNMP积累显著增加。特别是在Hvo ΔrnhB突变株中，rNMP的出现频率高达约每900个碱基对就有一个rNMP，而在野生型中仅为每1460个碱基对一个rNMP。这一发现证实了RNase HII在古菌rNMP修复中的核心作用。

为了在全基因组范围内精确绘制rNMP的分布图谱，研究团队采用了核糖核苷酸测序(ribose-seq)技术。该技术能够以单核苷酸分辨率检测基因组中嵌入的rNMP。通过对两种古菌的野生型和RNase H突变株进行ribose-seq分析，研究人员获得了丰富的rNMP分布数据。

研究发现，rNMP的分布并非随机，而是在基因组中呈现出特定的模式。在Hvo ΔrnhB突变株中，rNMP在前导链和滞后链上的分布显示出明显的不对称性，并且在已知的复制起点(oriC1, oriC2, oriC3)处出现了链切换特征。这一发现表明，rNMP的分布模式可以作为复制起点和复制叉方向的天然标记。有趣的是，在T. barophilus中并未观察到类似的链切换模式，这与该菌株在活跃增殖细胞中复制起点使用率较低的已知现象一致。

研究人员还分析了rNMP掺入的序列偏好性。在Hvo ΔrnhB突变株中，rCMP和rAMP成为主要的rNMP类型，而在野生型中则是rGMP占主导。序列上下文分析发现，在rNMP掺入位点周围存在特定的序列 motif，如Hvo中的5'-CGGCT-3'和Tba中的5'-CCC-3'，表明DNA序列环境会影响rNMP的掺入效率。

为了探究rNTP/dNTP池平衡对rNMP掺入的影响，研究人员通过高效液相色谱(HPLC)测定了细胞内核苷酸的浓度。结果显示，在两种古菌中，rNTP的总量都是dNTP的10倍以上，这种不平衡可能是rNMP被频繁掺入DNA的重要原因。值得注意的是，在RNase H突变株中，某些核苷酸的比例发生了变化，如Tba ΔrnhB中ATP比例下降而UTP比例上升，这可能影响了rNMP掺入的偏好性。

研究还发现，当同时缺失RNase HI和RNase HII时，rNMP的积累量反而低于仅缺失RNase HII的情况，提示可能存在备份修复机制。进一步缺失 flap 内切酶1(Fen1)后，rNMP积累量进一步下降，表明古菌中可能存在多种酶协同作用，共同维持基因组的稳定性。

关键技术方法

本研究主要运用了四种关键技术：核糖核苷酸测序(ribose-seq)用于全基因组范围rNMP定位；碱性水解凝胶电泳用于半定量评估rNMP积累；高效液相色谱(HPLC)用于定量分析细胞内dNTP和rNTP池；生物信息学分析用于处理测序数据和识别rNMP分布模式。实验材料为实验室培养的Haloferax volcanii H53株和Thermococcus barophilus MP株及其RNase H基因缺失突变株。

基因组范围内rNMP位点在RNase HI和RNase HII突变株中的积累

通过ribose-seq技术，研究人员在两种古菌的基因组中检测到了大量rNMP位点。在Hvo ΔrnhB突变株中，rNMP的出现频率最高，而在ΔrnhA突变株中的积累模式与野生型相似，表明RNase HII在rNMP修复中起主要作用。rNMP在染色体和质粒上的分布分析显示，染色体上的rNMP数量远多于质粒，可能与它们的大小差异有关。rNMP的分布还显示出明显的冷点区域，如Hvo中的16S和23S核糖体RNA基因区域，而在Tba中，16S rRNA基因区域反而是rNMP的热点区域。

RNase HI和RNase HII突变株中rNMP位点的全基因组精细定位

链特异性分析发现，在Hvo ΔrnhB突变株中，前导链和滞后链上的rNMP分布在三个染色体复制起点(oriC1, oriC2, oriC3)处出现交叉，这种模式与复制起点的使用一致。而在Tba中未观察到类似模式，反映了其低起点使用特性。这一发现表明，rNMP分布可以作为研究DNA复制动态的有力工具。

ΔrnhB突变细胞系中基因组rNMP碱基组成的变化

rNMP的碱基组成在RNase H突变株中发生了显著变化。在Hvo ΔrnhB突变株中，rCMP和rAMP的比例大幅上升，而rUMP的比例下降。在Tba ΔrnhB突变株中也观察到了类似趋势，rCMP成为最主要的rNMP类型。这些变化可能与突变株中核苷酸池的改变有关。

rNMP掺入位点侧翼碱基分布揭示共有 motif

序列分析发现，rNMP的掺入受到周围序列环境的影响。在Hvo中，rNMP位点上游偏好dA，下游存在5'-CGGCT-3' motif；而在Tba ΔrnhB中，上游偏好5'-CCC-3' motif，下游偏好dG。这些序列偏好性可能反映了DNA聚合酶在掺入rNMP时的序列特异性。

无论RER功能障碍和核糖核苷酸掺入如何，核苷酸池的定量分析

核苷酸定量结果显示，在两种古菌中，rNTP的总量都是dNTP的10倍以上，这种不平衡可能是rNMP被频繁掺入DNA的原因。在RNase H突变株中，某些核苷酸的比例发生了变化，如ATP/dATP比值在突变株中普遍下降，这可能影响了rNMP掺入的偏好性。

本研究通过全基因组范围的rNMP定位，揭示了古菌中rNMP掺入和修复的特有机制。研究发现RNase HII是古菌中主要的rNMP修复酶，其缺失会导致rNMP在基因组中大量积累。同时，RNase HI和Fen1可能作为备份修复途径发挥作用。研究还首次利用rNMP分布模式成功识别了古菌复制起点的链切换特征，为研究古菌DNA复制提供了新方法。

这些发现不仅增进了我们对古菌基因组稳定性维持机制的理解，也为认识生命三域中rNMP代谢的进化提供了重要线索。古菌作为生命演化中的重要分支，其独特的rNMP代谢机制可能反映了早期生命的适应性策略，对理解生命起源和进化具有重要意义。此外，研究中建立的ribose-seq技术在古菌中的应用，为未来研究其他微生物中的rNMP代谢奠定了基础。