合成聚合物生命周期设计新范式：微生物合成聚羟基脂肪酸酯（PHA）的绿色循环之路

《National Science Review》：Life cycle design of polyhydroxyalkanoates (PHA)

本文聚焦全球塑料污染危机，系统综述了聚羟基脂肪酸酯（PHA）作为可生物降解聚酯的全生命周期设计策略。研究团队通过微生物底盘工程、海水基Halomonas生物制造及低能耗下游加工技术，显著降低淡水消耗与能源输入。PHA的结构多样性支持从可堆肥包装到长期生物医用器件的广泛应用，其废弃后可通过生物降解、厌氧消化及化学回收实现材料高效回收并重新融入自然碳循环。生命周期评估（LCA）一致表明，相较于传统塑料，PHA可显著减少温室气体排放、化石资源依赖及海洋富营养化风险。该研究为可持续PHA基聚合物系统的设计原则提供了重要理论支撑与实践路径。

　　

随着现代社会和全球经济的持续发展，一次性塑料的需求激增，显著加速了塑料生产的步伐。近期研究估计，全球塑料消费量将在未来几十年内增长数倍，这主要源于基于化石原料的原始塑料的使用。这种急剧扩张，加上传统塑料的持久性和不可生物降解性，由于塑料在环境中的长期积累和微塑料污染，对生态系统和人类健康构成日益严重的威胁。塑料产量的激增，加上传统塑料固有的不可生物降解性，加剧了环境和公共健康风险。解决这一问题需要综合策略，包括减少塑料生产、改进废物管理以及推进可生物降解替代品的研究。为了调和不断增长的塑料需求与环境可持续性这双重挑战，从线性（生产-使用-丢弃）向循环（设计-再生-再设计-再利用）生产模式转型已变得至关重要。像聚羟基脂肪酸酯（PHA）这样的可生物降解聚合物正是这种范式转变的典范。

PHA是一类由微生物在碳源过量、营养失衡和其他生长胁迫条件下，作为细胞内碳和能量储存化合物以及胁迫保护剂而合成的聚酯家族，它们以离散的包含体形式积累。由于其可与传统塑料相媲美的材料特性，PHA被公认为可生物降解的替代品，并因其卓越的属性而受到广泛研究关注，这些属性包括优异的生物相容性、无毒且环境友好的降解产物以及化学可调的物理化学特性。至关重要的是，PHA的微生物生物合成符合生命周期设计（设计-再生-再设计）理念，这与传统的塑料生产模式（生产-使用-丢弃）形成鲜明对比。这种生物生产策略利用微生物代谢工程实现碳中性合成，将PHA定位为循环生物经济倡议的基石材料，同时应对塑料污染和资源可持续性的关键挑战。

生命周期评估（LCA）是一个方法学框架，专门用于评估产品生命周期所有阶段（从摇篮到坟墓）相关的环境影响，包括原材料提取（摇篮）、生产、利用以及废弃管理（坟墓）。PHA聚合物的生命周期设计构成了一个系统的设计理念，它将可持续性考量整体整合到PHA生产链的各个环节——从生物质原料获取和生物过程实施，到产品应用，直至最终的废物管理和环境降解。随着20世纪90年代初绿色化学概念的形成，研究人员随后制定了全面的LCA协议，这两种框架都强调环境管理和可持续发展。PHA聚合物在绿色设计指标和LCA中可以表现出良好的性能，特别是在替代化石燃料和降低全球变暖潜能方面，前提是生产链的每一步都经过仔细优化。

PHA聚合物由可再生的、可循环利用的天然生物质或其他低碳原料合成，并在其生命周期结束时通过回收或生物降解以对环境负责的方式进行管理。这些微生物合成的生物聚合物在其整个生命周期中展现出固有的可持续性，通过实现闭环材料流与循环经济范式保持一致。可持续PHA聚合物的生命周期从原料获取延伸到闭环再生。

本综述采用从摇篮到坟墓的生命周期设计框架，全面评估PHA作为可持续生物聚合物。从微生物底盘工程用于生物合成开始，分析了优化碳源选择（例如，废物衍生原料）和发酵过程的策略，这些策略可将淡水消耗减少高达70%。后续部分整合了下游提取创新，例如自絮凝微生物细胞，这将能源使用降低了40%，溶剂投入减少了35%，直接与循环生产目标保持一致。该工作进一步建立了PHA单体组成（例如，短链与中链）与其生命周期性能之间的结构-功能关系——将快速生物降解性（在土壤中<60天）与一次性包装设计联系起来，同时定制慢降解变体用于耐用的医疗植入物。通过标准化的LCA指标量化消费后环境影响，显示与常规塑料相比，全球变暖潜能降低了58%（2.1 kg CO₂-eq/kg PHA）。最后，我们提出了闭环再生系统，其中降解的PHA副产物作为碳源重新进入生产循环，在试点研究中实现了近零废物阈值。

在微生物工程和生物过程优化进展的基础上，强大的微生物平台现在为设计高效且环境友好的PHA生产过程奠定了基础。这些平台能够可持续生产多种化学化合物、天然产物和微生物聚酯，如PHA。微生物合成的PHA的结构和组成取决于所使用的碳源和代谢途径。这些变化影响聚合物特性、过程效率和对LCA至关重要的环境影响。

许多微生物，包括细菌、古菌和真菌，都能够生产PHA；然而，细菌菌株仍然是商业生产的主要宿主。Cupriavidus necator (C. necator) 是一种广泛使用的革兰氏阴性菌株，用于PHB、聚((R)-3-羟基丁酸酯-co-4-羟基丁酸酯) (P3HB4HB) 和聚((R)-3-羟基丁酸酯-co-(R)-3-羟基戊酸酯) (PHBV) 的工业化生产。该菌株可在72小时内达到高达200 g/L的细胞干重，且PHB积累量可达细胞干重（CDW）的80%，并拥有RuBisCO基因，能够通过固定CO₂进行自养生长。

在清华大学，我们建立了一个使用Halomonas bluephagenesis作为底盘生物的工业PHA生产平台，展示了用于经济高效和可扩展PHA制造的下一代工业生物技术（NGIB）。Halomonas bluephagenesis TD01是一种嗜盐菌株，适用于开放（非无菌）发酵，在盐水培养基中进行葡萄糖补料分批培养时，可在56小时内达到80 g/L细胞干重和80%的PHB含量。形态工程和靶向遗传修饰的最新进展进一步改进了Halomonas spp.，使其在5000 L生物反应器中44小时的发酵期间，细胞干重达到149 g/L，PHB含量达到82%。

总的来说，这些发展表明，定制的微生物平台可以显著提高PHA生产的效率、可扩展性和环境性能，为PHA材料的生命周期评估提供了无缝过渡。

传统的工业生物技术依赖于常规微生物，如大肠杆菌、芽孢杆菌属、谷氨酸棒杆菌、酵母等，来生产化学品、燃料或PHA。然而，这种方法需要能源密集的灭菌过程和复杂的下游操作，导致大量的淡水消耗和高生产成本，这降低了PHA大规模应用的经济性。近年来，基于嗜盐微生物的NGIB已成为PHA可持续生命周期设计的变革性解决方案：通过整合耐盐底盘细胞、开放连续发酵和智能下游加工技术，NGIB为PHA生产提供了一种革命性的方法。嗜盐微生物，特别是Halomonas，利用其独特特性在非无菌海水培养基中高效合成PHA。这种方法能够实现废水回收和废盐再利用，显著减少资源消耗和碳排放。

在上游微生物细胞优化方面，代谢工程扩展了Halomonas的底物利用范围，使其能够利用低成本碳源，如木质纤维素水解产物、食物垃圾以及来自农业和工业废物的CO₂。在中游培养中，开放连续发酵和高密度培养技术大幅降低了生产过程中的能耗。最后，在下游加工中，形态工程增强了微生物细胞的自动沉降特性。结合细胞内PHA颗粒尺寸调控、自絮凝和自裂解系统，这些创新简化了分离过程，使得无需离心即可实现高效的PHA提取。

Halomonas因其卓越的耐盐性、抗污染能力、便于放大和广泛的底物利用而成为NGIB的优秀底盘。通过系统的代谢工程和发酵过程优化，Halomonas在原材料利用方面展现出显著优势，有效减少资源消耗，最小化环境污染，并增强经济和社会效益。

Halomonas能够代谢多种低成本碳源，包括工业和农业废物，从而显著降低生物制造的总成本。例如，Halomonas campaniensis LS21分泌胞外酶，包括淀粉酶、脂肪酶和纤维素酶，使其能够在补充了纤维素和厨房垃圾等混合底物的非无菌海水培养基中连续稳定发酵超过65天。类似地，经过工程改造的H. bluephagenesis TD01，携带必需基因ompW及其后的PHA合成phaCAB操纵子，表现出对食物垃圾增强的适应性，克服了批次间成分的变异性，实现了稳定的PHA生产。此外，石油和煤衍生的化学副产品（例如，CO₂、甲酸盐、甲醇、乙酸盐）、塑料降解中间体（例如，1,4-丁二醇）、木质纤维素水解产物和农业残留物（例如，脱脂米糠、碾米废水）已被成功地重新用作Halomonas的替代碳源，从而扩大了原料多样性。

在木质纤维素利用方面，H. bluephagenesis的代谢工程使得木质纤维素水解产物能够高效转化为PHB。通过引入木糖特异性转运蛋白和四种不同的木糖利用途径——木糖异构酶（XI）、木酮糖-1-磷酸（1-P）和核酮糖-1-磷酸（R-1-P）——该菌株在使用木质纤维素水解产物的7 L发酵罐中实现了62 g/L的细胞干重和67%的PHB含量。此外，Halomonas cupida J9采用葡萄糖/木糖共喂策略，在开放、非无菌条件下，使用玉米秸秆水解产物在5 L生物反应器中达到了7.0 g/L CDW和2.45 g/L PHA效价。

为了克服Halomonas菌株降解复杂底物固有的有限能力，已采用代谢工程策略来增强其降解和生物合成能力。例如，经过工程改造的H. bluephagenesis分泌淀粉酶和葡萄糖苷酶，使其能够直接利用玉米淀粉生产PHB，在摇瓶培养中达到10 g/L CDW和51% PHB含量。在乙酸盐利用方面，H. bluephagenesis B71的适应性实验室进化（ALE）提高了乙酸盐耐受性和PHB生物合成效率，在补料分批发酵中产生70 g/L CDW和50 g/L PHB。

最近的CO₂固定工程进一步拓宽了Halomonas的底物谱。在大肠杆菌中过量表达磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PckA）增强了CO_{2同化作用，将PHB含量从73%提高到78%，PHB效价从7.2 g/L提高到8.7 g/L。此外，某些物种如Halomonas rowanensis利用还原性三羧酸（rTCA）循环进行CO2固定，为碳中性生物技术提供了新的见解。}

Halomonas固有的耐盐性和高pH耐受性使其能够进行非无菌连续发酵，从而大幅降低能耗和设备成本。采用Halomonas spp.的开放、非无菌发酵消除了能源密集的灭菌步骤，与传统的分批过程相比，淡水消耗减少了60%，运营成本降低了45%。这种方法与工业可扩展性保持一致，同时最小化碳足迹（2.1 kg CO₂-eq/kg PHA 对比 5.8 kg CO₂-eq/kg PET）。表型微阵列分析显示，Halomonas bluephagenesis TD01能够利用190种测试化合物中的140种，包括乙酸钠、甘油、乙醇和乳酸，凸显了其代谢多样性。值得注意的是，Halomonas bluephagenesis TD01对高浓度盐表现出强大的耐受性，在75 g/L乙酸钠、100 g/L琥珀酸盐和衣康酸盐条件下，生长速率仅分别下降56%、53%和47%。当使用乙酸盐作为底物时，工程化的Halomonas菌株不仅高效合成PHB，还在开放培养条件下通过引入的MVA途径产生121 g/L甲羟戊酸（MVA）。这些技术降低了原料成本，同时实现了废物流的价值化，通过减少甲烷排放与循环经济原则保持一致。

尽管取得了显著进展，但仍需进一步研究以阐明Halomonas中的碳固定途径和复杂底物代谢。例如，Halomonas中的硫代硫酸盐驱动的化学自养途径仍然特征不清，识别和表征相关基因可能为无机底物利用开辟应用。此外，开发多底物共利用策略、优化代谢通量分布以及产品多样化（例如，中链和短链PHA共聚物、小分子化学品）仍然是关键优先事项。

通过合理设计和工程化，Halomonas物种实现了将废物高效转化为高附加值产品，减少了资源消耗、环境负担和生产成本。Halomonas工程和生物过程设计的进展正在实现闭环聚合物系统，其中PHA由废物衍生的碳源合成，并最终通过生物降解回归环境。

PHA作为环境友好和可生物降解的材料，因其在整个产品生命周期中可持续设计的潜力而受到广泛关注。然而，传统的PHA生物制造过程面临诸如过度淡水消耗、能源密集的灭菌程序和复杂工艺设备等挑战，导致资源效率低下和生产成本高。最近在工程化嗜盐细菌作为底盘细胞方面的进展为PHA生产提供了变革性的解决方案，利用了它们对极端环境的独特适应性及其对合成生物学修饰的适用性。此处我们重点介绍嗜盐细菌在关键维度上的应用创新，包括节水、能源效率、连续发酵和高细胞密度培养，强调它们对推进PHA可持续制造的影

响。

传统的PHA生产在很大程度上依赖淡水，主要用于生长培养基、设备清洁、温度控制、洗涤和冷却过程。嗜盐细菌，如Halomonas物种，具有使用海水（或人造海水）替代淡水的明显优势，从而减少对淡水资源的依赖。此外，它们的代谢途径允许同时合成PHA和高附加值产品，如四氢嘧啶（ectoine）、3-羟基丙酸酯、酶、蛋白质和化学品，进一步提高了资源利用效率。

就能耗而言，嗜盐细菌的耐盐性（pH > 8.5）使它们能够在开放环境中茁壮成长，自然抑制其他微生物的污染。这一特性消除了传统发酵过程中高温灭菌步骤的需要，简化了工作流程，降低了对耐热性的设备要求，从而显著降低了能耗。此外，通过合成生物学方法对嗜盐细菌进行代谢重编程，增强了它们对低氧条件的适应性。例如，Ouyang等人通过引入vgb基因（编码来自Vitreoscilla的血红蛋白）并利用双精氨酸转运（Tat）途径将其定位到周质空间，证明了在低氧条件下细胞干重增加了两倍。结合辅因子比率调节（例如，NADH/NAD⁺平衡）和定向进化，系统性地提高了嗜盐细菌在低氧条件下的PHA合成效率，为减少与空气压缩机相关的能耗提供了一种实用方法。

传统的分批发酵过程经常因培养物处理和反应器灭菌而中断，导致周期延长和劳动力成本增加。嗜盐细菌卓越的环境适应性为连续发酵技术的应用奠定了基础。该技术通过持续供应新鲜培养基和排出发酵液，保持反应器内的稳态，使微生物处于对数生长期，从而提高生产率。研究表明，连续发酵通过培养基回收降低了淡水需求和废水处理负荷。Halomonas已在实验室规模（7 L）和大型规模（1-5 m3）的非无菌条件下成功测试，证明了其工业可行性。

在传统工艺中，高浓度的产品可能会抑制微生物代谢，而在连续模式下，产品随着发酵液的流动被动态稀释，保持稳定的生产速率。此外，嗜盐细菌创造的高盐度和碱性环境自然防止了其他微生物的污染，为开放操作提供了独特的保障，并进一步降低了设备和操作复杂性。

高密度培养是通过增加单位体积细胞密度来提高PHA生产效率的关键策略，这提高了生产率并降低了下游分离成本。Halomonas TD01的一个衍生物在开放连续发酵期间实现了100 g/L的细胞干重和60.4%的PHA含量。这一突破是通过迭代的“突变-筛选”策略优化代谢途径实现的，例如重编程氧化还原网络以平衡细胞内代谢通量，从而显著提高底物转化效率。

放大生产验证进一步强调了该技术的工业潜力。Halomonas已成功放大到225 m3发酵罐用于PHA生产，标志着从实验室到工业规模应用的成功过渡。未来的努力应侧重于开发更稳定的突变体，以增强菌株在高温、低氧和低盐度等极端条件下的鲁棒性，从而解决大规模生产复杂性降低的问题。

Halomonas作为底盘细胞的应用通过整合海水利用、无灭菌方案、连续发酵和高密度培养，系统地重组了PHA生产过程。这些创新显著减少了资源消耗和碳排放，从而为成本优化提供了技术支持，并与可持续生命周期设计的目标保持一致。虽然基于Halomonas的工业生产系统为大规模应用奠定了基础，但在微生物稳定性、精确代谢途径调控以及用于稳定PHA结构和分子量的智能发酵过程等领域仍需进一步研究。随着合成生物学和过程工程的深度融合，基于Halomonas的PHA生产有望成为生物制造领域的典范，推动可生物降解材料行业的全面升级。

细菌形态工程在提高微生物下游加工效率和细胞内产物积累方面具有巨大潜力。研究揭示，对细胞形状决定基因（例如，ftsZ、sulA和mreB）进行靶向遗传修饰可使微生物具备自沉降特性。在Halomonas spp.中，敲除mreB可将杆状细胞转化为球形，而敲除ftsZ则诱导丝状细胞形态形成。这两种修饰后的形态通过增加细胞体积或改变流体动力学特性，使自然沉降速率比野生型菌株提高了三倍以上。值得注意的是，这种形态驱动的自分离策略已成功整合到Halomonas bluephagenesis的非无菌连续发酵中，用于PHA生产，与基于离心的传统方法相比，提取效率提高了69%-82%，纯化成本降低。可加工性的增强源于不同的机制：细长细胞利用增加的表面积与体积比来增强重力沉降，而球形形态则最大化细胞体积和重量以加速沉淀。这一原理超越了细胞形态，延伸到细胞内产物结构。在Halomonas bluephagenesis中，小PHA颗粒带来的分离挑战可以通过同时调控颗粒大小和细胞形态来克服。phasin蛋白PhaP1、PhaP2和PhaP3在控制PHA颗粒形态中扮演不同角色：phaP1敲除菌株产生几乎充满整个细胞空间的单个大PHA颗粒，而phaP2/phaP3缺失导致颗粒适度增大，表明它们不同程度地参与颗粒稳定和尺寸调控。同时过表达细胞分裂抑制剂MinC和MinD创造了扩大的细胞区室，可容纳直径达10 μm的PHA颗粒。这些发现表明，PHA颗粒尺寸从根本上受宿主细胞尺寸的限制。通过协同结合形态扩张和颗粒尺寸调控策略，该研究实现了适用于机械分离的超大PHA颗粒。未来的方向包括多路基因调控以同步形态优化与产物合成，以及过程放大的规模研究。这种向“为分离而设计”微生物底盘的范式转变，可能通过同时增强上游生产力和下游可回收性，彻底改变可持续生物生产。

工程化的自絮凝菌株减少了对密集离心的依赖，将下游能耗降低了约40%，溶剂投入减少了35%。此类创新在降低纯化成本的同时提高了过程可持续性。在程序化细胞裂解系统方面也取得了并行进展：将噬菌体SRRz裂解基因与合成核糖体结合位点进行染色体整合，创建了应激诱导的“自裂解”菌株。这些工程系统允许通过加工过程中的溶剂诱导或营养耗尽时的自发裂解来实现可控的产品释放，从而有效避免了机械破碎的需要。未来在连续发酵平台中实施这些方法有望建立用于工业生物聚合物生产的全自动、无离心生物加工流程。

形态工程、胞外多糖（EPS）修饰和基于噬菌体的裂解系统的协同整合代表了一种有效的下游生物加工方法。通过将细胞形状优化与EPS缺陷型自絮凝相结合，这些策略减少了对密集离心的依赖，同时通过增强细胞渗透性提高了产物提取效率。细胞自溶系统进一步简化了细胞内产物的释放，共同降低了纯化成本。未来的努力应优先考虑在连续发酵平台中对这些参数进行多路控制，以建立全自动、无离心的工作流程。这种“为分离而设计”的范式，使上游生产与下游可回收性同步，有望通过能量和经济优化的过程推进可持续PHA生产的工业规模生物制造。

PHA也可以通过化学催化途径合成。主导策略是内酯和相关环状酯的开环聚合（ROP）。四元β-丁内酯（β-BL）和八元二醇化物（8DL）的ROP使得能够立体专一地合成等规P3HB，并具有可控的分子量和分散度。因此，催化剂和单体设计在决定化学合成PHA的立构规整度方面起着核心作用。最近的进展还包括利用C4二醇和空气通过协同催化γ-丁内酯的ROP仿生合成P4HB，为P4HB类似物提供了一条高效温和的路线。此外，立体异构聚合策略使得能够将天然(R)-P3HB转化为所有对映体纯的双等规PHA非对映异构体，克服了生物途径仅提供单一立体构型的长期限制。

化学合成的一个主要优势是能够获得难以通过细胞代谢产生的聚合物结构，包括基于PHA的嵌段共聚物和拓扑复杂的结构。已经报道了从功能化PHA链段合成PHA嵌段共聚物的多种方法。此外，最近开发了α,α-二取代PHA平台，以同时解决机械脆性、热不稳定性以及对闭环化学可回收性的需求，从而产生坚韧、可熔融加工且化学循环的材料。

最近的几篇权威综述全面总结了这些进展，包括单体设计、催化控制、化学可回收性和功能性PHA结构的进展。总之，这些进展确立了化学合成PHA作为生物PHA的多功能补充，特别是在结构精度、