光驱动微生物代谢的昼夜振荡支撑河口生物地球化学韧性

《ISME Communications》：Light-driven diel oscillations in microbial metabolism underpin estuarine biogeochemical resilience

本研究针对河口浮游原核微生物群落对昼夜光周期响应的机制尚不清晰的问题，研究人员在珠江口开展了为期48小时的高频采样，结合16S rRNA基因测序、宏基因组学和宏转录组学等多组学方法，揭示了微生物多样性、互作网络和代谢功能的昼夜动态。结果发现，夜间微生物群落具有更高的α-多样性及更紧密的连接网络，异养过程增强；而白天则以蓝藻(Cyanobacteria)为主，光自养碳固定和氮同化途径富集。该研究阐明了光驱动昼夜振荡如何塑造微生物代谢分区和生态互作，为理解河口生态系统生物地球化学韧性的时间动态机制提供了新见解。

　　

河口，作为连接陆地与海洋的高度动态界面，因其高营养盐通量、显著的水动力梯度和极其多样的微生物群落，被公认为全球生物地球化学循环的关键热点区域。然而，在这些生态系统中，由地球自转决定的昼夜光周期，作为能量来源和调控信号，深刻影响着微生物的生理、代谢途径和群落动态。尽管这些昼夜振荡对塑造河口生物地球化学过程的重要性已得到认可，但浮游原核微生物群落对此类节律性环境变化的潜在机制响应仍未被充分阐明。特别是在珠江口这样的亚热带河口系统，其高营养负荷、强潮汐流和陡峭的生态梯度，孕育了高度动态的微生物群落，它们在调节碳固定、氮循环和硫转化等关键生物地球化学过程中扮演着关键角色。虽然先前研究记录了珠江口微生物群落沿空间和季节梯度的变化，但受昼夜光周期影响的微生物功能的时间分区在很大程度上仍未得到探索。具体而言，节律性的光可用性如何塑造该系统中浮游原核微生物的代谢特化、网络相互作用和整体生态策略，其机制仍然模糊不清。

为了解决这一知识空白，研究人员在珠江口一个中河口混合区站点进行了为期48小时的高分辨率采样。他们采用了一种整合的方法，结合16S rRNA基因扩增子测序、宏基因组学和宏转录组学，来解读微生物多样性、共现网络和代谢能力的昼夜变化。研究旨在量化α-多样性和群落组成的昼夜变化，重建微生物共现和相互作用网络以识别受光周期调控的关键类群和功能模块，并分析碳、氮、硫循环关键生物地球化学途径转录活性的昼夜变化。

为确保观察到的微生物群落结构和代谢活动的昼夜变化不受理化波动的影响，研究比较了白天和夜间样本的环境参数，结果显示温度、盐度、pH、溶解氧等参数在昼夜样本组间无显著差异，表明在48小时采样期间理化环境保持相对稳定。因此，本研究中发现的微生物多样性和转录谱的昼夜变化主要反映了生物对周期性光暗循环的响应。

通过分析，研究人员揭示了微生物群落结构和功能的显著时间分区。在群落多样性方面，夜间样本的物种丰富度、香农熵和逆辛普森指数均显著高于白天，表明夜间微生物群落的分类学复杂性和多样性更高。然而，基于Bray-Curtis相异度的非度量多维标度排序并未揭示昼夜组间整体微生物群落组成的显著差异，暗示尽管存在微小的组成变化，但整体群落结构在昼夜周期内保持相对稳定。

微生物相互作用网络分析揭示了昼夜光周期下群落结构的显著差异。夜间网络（900个节点，57,119条边）比白天网络（735个节点，33,474条边）表现出更高的复杂性和连接性，具有更高的平均度、图密度和聚类系数，表明夜间微生物相互作用更广泛、更紧密。关键类群（Keystone Taxa）的分析也显示出昼夜差异：夜间网络的关键节点主要为黄杆菌目(Flavobacteriales)和Blfdi19等，作为连接器(Connectors)；而白天网络的关键节点则以聚球藻菌目(Synechococcales)为主，作为模块中心(Module Hubs)。这表明昼夜光周期显著影响微生物群落结构和连接性，夜间条件与更密集的网络结构相关，可能促进如养分循环等合作关系；而白天的群落则表现出更强的模块性和功能特化潜力，可能与光合作用等光依赖过程相关。

代谢功能分析进一步证明了关键生物地球化学过程的显著昼夜振荡。在碳代谢方面，宏转录组分析显示，白天碳水化合物活性酶(CAZyme)家族如糖基转移酶(GTs)和糖苷水解酶(GHs)占主导，反映活跃的碳水化合物合成和降解。特定酶如GH84仅在夜间表达，而碳水化合物酯酶家族CE5和CE19以及多糖裂解酶PL1和PL9则分别仅在白天或夜间有活性，表明跨昼夜周期的多糖降解途径不同。在自养碳固定方面，参与光合作用和卡尔文循环(Calvin Cycle)的基因在白天表达更高。此外，3-羟基丙酸双循环(3-hydroxypropionate bicycle)的一个基因(K14469)仅在夜间低水平表达，暗示了特殊的自养碳固定活性。

甲烷代谢也表现出昼夜动态。编码三甲胺甲基转移酶的mttB基因在夜间表达更高，可能促进黑暗时期的甲基营养型产甲烷作用。而编码乙酰辅酶A合成酶的acss1_2基因在白天表达更高，表明碳同化过程在光照条件下更受青睐。编码一氧化碳脱氢酶复合物亚基的cooF和cooS基因在夜间富集，暗示夜间一氧化碳氧化速率增加。

在氮循环中，参与同化硝酸盐还原（将硝酸盐转化为铵用于生物合成）的nirA基因在白天表达显著高于夜间，表明在光源充足时，通过硝酸盐还原的氮同化作用增强。其他硝酸盐还原酶基因，如narI和napB，在白天也相对富集。参与厌氧氨氧化(Anammox)的羟胺合酶亚基基因K20934在白天表达升高。此外，参与氨氧化的关键基因（amoA, amoB, amoC）和亚硝酸盐还原基因（nirK, nirD）在昼夜之间表现出差异表达，反映了光暗周期对硝化作用的昼夜调控效应。

在硫循环中，白天以同化硫酸盐还原相关基因（sat, cysN, cysD, cysC, cysH, sir, cysJI）的转录升高为特征，反映了光照条件下合成代谢活性和含硫氨基酸/辅因子生物合成的增强。相反，夜间与异化硫还原（aprAB, dsrAB）和硫氧化（fccAB, SUOX, soeABC）相关的基因表达增加，表明黑暗时期向厌氧能量代谢的转变。SOX系统基因（soxA至soxZ）总体在夜间表达更高。这些数据表明硫代谢存在昼夜转换：白天的同化过程主导生物合成，而夜间能量产生的硫氧化和还原途径更活跃。

为识别参与昼夜代谢变化的关键微生物类群，研究从24个表层水宏基因组样本中重建了总共786个高质量和中质量的宏基因组组装基因组(MAGs)。这些MAGs涵盖10个门，大多数属于假单胞菌门(Pseudomonadota)、拟杆菌门(Bacteroidota)和蓝藻门(Cyanobacteriota)。值得注意的是，所有蓝藻门MAGs均归属于Cyanobiaceae科，其在白天与光合作用、碳固定和有机碳降解相关的基因转录显著升高。这些MAGs在碳、氮、硫代谢基因的转录活性上表现出明显的昼夜波动。Cyanobiaceae在白天表现出卡尔文循环、rTCA循环、Wood-Ljungdahl途径和3-羟基丙酸双循环相关基因的高表达，表明它们是河口地区的主要光养自养菌。在氮循环中，四个MAGs（其中三个是蓝藻门）在白天显示出同化硝酸盐还原基因(nirA)的更高表达。硫代谢的昼夜变化主要通过同化硫酸盐还原基因表达的变化体现，白天活跃的MAGs包括蓝藻门、Halieaceae和Burkholderiacceae_B，而夜间活跃的类群如BA12和GCA-2862545在夜间对硫途径贡献更大。有机碳降解酶和光合复合物基因的表达也表现出明显的类群特异性和时间模式。

本研究采用的关键技术方法包括：在珠江口中河口混合区进行48小时高频采样，收集颗粒附着(PA)和自由生活(FL)微生物样品；利用16S rRNA基因扩增子测序分析微生物群落多样性和组成；运用宏基因组测序进行功能基因注释和宏基因组组装基因组(MAGs)重建；通过宏转录组测序分析功能基因的表达活性（以RPKM值表示）；基于SparCC相关性构建微生物共现网络并分析其拓扑性质；使用DESeq2进行差异基因表达分析。

研究结果揭示了珠江口浮游原核微生物群落对昼夜光周期的显著响应。环境稳定性分析确认了观测到的变化主要源于生物对光暗循环的响应。微生物群落多样性分析显示夜间α-多样性显著高于白天，但β-多样性无显著差异。微生物共现网络分析表明夜间网络具有更高的复杂性和连接性，关键类群的生态角色存在昼夜转换。代谢功能分析揭示了碳、氮、硫循环关键途径基因表达的显著昼夜振荡，表明白天以同化/合成代谢为主，夜间则以异化/能量代谢为主。通过宏基因组组装基因组(MAGs)分析，明确了Cyanobiaceae等关键类群在昼夜代谢分区中的核心作用，显示了代谢生态位分离的机制。

该研究结论表明，昼夜光周期驱动了珠江口微生物群落结构和功能的显著时间分区。夜间阶段具有更高的α-多样性和更强的网络连接性，促进了有机质降解和异化硫还原等异养过程；而白天群落则以蓝藻为主，上调了包括碳固定和氮同化在内的光自养途径。这些发现建立了光驱动昼夜振荡与微生物适应策略之间的直接机制联系，突出了时间动态如何支撑河口生态系统的生物地球化学韧性。该研究为理解微生物昼夜节律提供了一个高分辨率框架，并为未来研究生态系统尺度建模和气候变化对沿海生物地球化学循环的影响奠定了基础。

讨论部分进一步阐述了研究结果的意义，指出微生物功能的时间分区对河口生物地球化学具有重要影响。白天的自养活动通过碳固定增强了净生态系统生产力，而夜间的异养过程促进了有机质降解和养分循环，并可能影响CO₂和CH₄等温室气体通量。代谢途径的时间分离有助于生态系统韧性，通过将合成代谢和分解代谢功能分配在昼夜周期中，微生物群落可以缓冲资源可用性的环境随机性。网络分析揭示的关键代谢模块由多种类群支持的功能冗余性，可能赋予生态系统在环境扰动下的稳健性。与淡水和海洋系统的比较揭示了共性和差异，河口系统中观测到的昼夜代谢振幅往往被放大，反映了河口固有的动态理化背景对微生物响应光强迫的调节作用。研究也指出了当前工作的局限性，如采样时间窗口、群落水平测量的分辨率以及未探索的生物相互作用（如病毒裂解、原生动物捕食）的影响，为未来研究方向提供了建议。