乳酸驱动的HNRNPA1乳酰化调控PKM2剪接与膀胱癌糖酵解重编程

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：Lactate-driven lactylation of HNRNPA1 orchestrates PKM2 splicing and glycolytic reprogramming in bladder cancer

本研究针对膀胱癌(BLCA)中乳酸驱动的蛋白质乳酰化修饰的功能机制不清这一关键问题，研究人员系统探讨了HNRNPA1-K350位点乳酰化在调控PKM2选择性剪接及糖酵解重编程中的核心作用。研究发现P300介导的HNRNPA1乳酰化通过促进PKM2表达增强有氧糖酵解，从而驱动BLCA进展。该研究揭示了代谢物修饰与RNA剪接调控之间的新型关联，为靶向HNRNPA1-K350乳酰化/PKM2轴治疗BLCA提供了新策略。

　　

在泌尿系统恶性肿瘤中，膀胱癌(Bladder Cancer, BLCA)的全球发病率位居第十位，虽然手术切除是标准治疗方案，但该疾病具有高复发率和侵袭性强的特点，导致患者预后不良。目前临床上缺乏特异性的分子诊断标志物和有效的治疗策略，这促使科研人员需要深入探索BLCA发生发展的分子机制。癌症的一个显著特征是代谢重编程，其中瓦博格效应(Warburg effect)尤为突出，即肿瘤细胞即使在有氧条件下也倾向于将葡萄糖发酵产生乳酸（有氧糖酵解）。这种代谢转变使得快速增殖的肿瘤细胞能够满足其增加的生物能量和生物合成需求。乳酸作为增强糖酵解的副产品，不仅仅是代谢废物，肿瘤中高水平的乳酸与侵袭、免疫逃逸和治疗抵抗相关。更重要的是，乳酸等代谢物可以作为新型蛋白质翻译后修饰(Post-Translational Modification, PTM)的底物，将代谢与表观遗传和信号通路联系起来。

乳酸化(Lactylation)是一种新发现的由乳酸衍生的蛋白质翻译后修饰，其中乳酸分子共价连接到赖氨酸残基上。组蛋白乳酸化已被证明可以作为表观遗传标记直接刺激基因转录，例如在眼黑色素瘤中，组蛋白H3K18乳酸化水平升高可上调m⁶A阅读器YTHDF2，促进肿瘤抑制性mRNA（如PER1和TP53）的降解，从而加速肿瘤生长。尽管糖酵解在BLCA中经常失调，但乳酸化在此背景下的确切作用仍不清楚。除了组蛋白，非组蛋白的乳酸化也正在成为重要的调控机制，但其范围和功能后果才刚刚被揭示。考虑到BLCA肿瘤的高度糖酵解特性和由此产生的富含乳酸的微环境，研究人员假设非组蛋白的乳酸化可能在BLCA进展中扮演关键角色。

发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上的这项研究旨在探究蛋白质乳酸化是否有助于BLCA肿瘤发生，并识别关键的乳酸化底物和涉及的通路。通过全面的乳酸化蛋白质组学分析，研究人员发现异质核核糖核蛋白A1(Heterogeneous Nuclear Ribonucleoprotein A1, HNRNPA1)是BLCA中一个主要的乳酸化蛋白。HNRNPA1是一种广泛表达的RNA结合蛋白，已知可调控选择性剪接(Alternative Splicing)和RNA代谢，在驱动恶性转化的分子通路中扮演多重角色。值得注意的是，HNRNP的代谢调控作用并非固定不变，而是受到PTMs的动态调节。例如，在肝细胞癌中，SIRT1和SIRT6对HNRNPA1的赖氨酸残基进行去乙酰化，显著抑制了糖酵解。在肺腺癌中，ESCO2介导的HNRNPA1乙酰化有助于代谢重编程和肿瘤进展。然而，在本研究之前，HNRNPA1在BLCA代谢中的作用尚不清楚。

本研究证明，HNRNPA1的赖氨酸350(Lysine 350, K350)位点乳酸化在BLCA组织中显著升高。功能实验表明，无论是基因敲除HNRNPA1还是将K350替换为精氨酸(K350R)，都能在体外和体内显著抑制BLCA的恶性表型和有氧糖酵解。进一步研究确定P300是催化此修饰的乳酸转移酶。从机制上讲，HNRNPA1 K350的乳酸化通过调控丙酮酸激酶M2(Pyruvate Kinase M2, PKM2)的表达来促进肿瘤进展和代谢重编程。此外，通过分子对接虚拟筛选，研究人员发现小分子化合物虎杖苷(Polydatin)能够与HNRNPA1结合，抑制其乳酸化，并展现出抗肿瘤效果。这些发现揭示了一个先前未被认识的BLCA中非组蛋白乳酸化的功能，特别是破坏糖酵解-HNRNPA1-K350乳酸化-PKM2正反馈轴，为靶向BLCA的代谢脆弱性提供了一个有前景的治疗途径。

关键技术方法

本研究综合利用了临床样本分析、分子细胞生物学实验和动物模型。研究人员收集了BLCA患者组织样本构建组织微阵列，进行免疫组化(Immunohistochemistry, IHC)分析。通过乳酸化蛋白质组学（液相色谱-串联质谱法，LC-MS/MS）筛选差异乳酸化蛋白。利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建HNRNPA1基因敲除和点突变（K350R）的BLCA细胞系，并通过过表达系统进行功能回复实验。采用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)和Western Blot验证蛋白质相互作用和修饰。通过靶向代谢组学、糖酵解压力测试（海马分析仪）评估细胞代谢状态。利用伤口愈合、Transwell侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力。通过裸鼠皮下成瘤实验评估体内肿瘤生长。最后，采用受体基虚拟筛选从FDA批准药物库中寻找HNRNPA1潜在抑制剂。

研究结果

全局乳酸化在膀胱癌中升高并与不良预后相关

单细胞RNA测序分析显示，与正常尿路上皮细胞相比，BLCA尿路上皮癌细胞中乳酸化相关基因表达显著升高，且代谢通路（如糖酵解、丙酮酸代谢过程）显著富集。Western Blot和IHC证实BLCA组织和细胞系中整体乳酸化水平显著高于正常对照。乳酸化水平与肿瘤分期、分级呈正相关，并且是患者总生存期的独立预后因素。

乳酸驱动的蛋白质乳酸化促进膀胱癌细胞增殖和肿瘤生长

使用糖酵解抑制剂（2-DG, Oxamate）或siRNA敲低LDHA降低乳酸水平和蛋白质乳酸化后，BLCA细胞的增殖、克隆形成能力显著下降，凋亡增加。相反，在正常尿路上皮细胞SV-HUC-1中外源添加乳酸钠(NaLa)可提高乳酸化水平并增强其增殖能力。在裸鼠移植瘤模型中，乳酸补充加速了肿瘤生长。

HNRNPA1 K350乳酸化在膀胱癌组织中升高

乳酸化蛋白质组学分析在BLCA组织中鉴定出1146个乳酸化蛋白和2778个修饰位点，显著多于正常组织。其中，HNRNPA1的K350位点乳酸化在肿瘤中显著富集。通过定制位点特异性抗体，在BLCA样本中验证了HNRNPA1-K350乳酸化的存在，且该修饰受乳酸水平和糖酵解活性调控。

HNRNPA1-K350乳酸化促进BLCA进展

CRISPR/Cas9敲除HNRNPA1或引入K350R点突变均显著抑制了BLCA细胞的增殖、迁移、侵袭能力以及体内肿瘤生长。回复实验表明，重新表达野生型HNRNPA1(WT)可恢复这些恶性表型，而K350R突变体则无法完全回复，证明K350乳酸化对HNRNPA1的促癌功能至关重要。

HNRNPA1-K350乳酸化增强膀胱癌细胞的有氧糖酵解

代谢组学和功能分析显示，表达HNRNPA1-WT的细胞表现出典型的有氧糖酵解特征：葡萄糖摄取和乳酸产量增加，ATP水平相对较低，细胞外酸化率(ECAR)升高，NADPH/NADP⁺和GSH/GSSG比值升高。而HNRNPA1-KO或K350R细胞则表现出糖酵解减弱和氧化磷酸化增强的代谢特征。

P300作为HNRNPA1-K350乳酸化的酰基转移酶

Co-IP实验证实P300与HNRNPA1直接相互作用。过表达P300可增强HNRNPA1乳酸化，而抑制P300活性（使用抑制剂C646或siRNA敲低）则降低其乳酸化。P300在BLCA组织中高表达，且其表达水平与整体乳酸化水平呈正相关。

HNRNPA1-K350乳酸化通过驱动PKM2剪接促进有氧糖酵解和肿瘤侵袭性

机制研究表明，HNRNPA1-WT通过促进PKM前体mRNA的选择性剪接，偏向于产生PKM2亚型，而非PKM1亚型。这种剪接调控依赖于K350的乳酸化修饰。在HNRNPA1-K350R细胞中过表达PKM2，可以回复其糖酵解能力、增殖和侵袭表型，证明PKM2是HNRNPA1乳酸化下游的关键效应分子。乳酸、P300过表达或糖酵解抑制均能调控PKM2的表达，且该调控依赖于HNRNPA1的K350位点。

小分子药物虎杖苷抑制HNRNPA1乳酸化及其在膀胱癌中的生物学活性

虚拟筛选发现虎杖苷与HNRNPA1的RNA结合口袋具有高亲和力。体外实验表明，虎杖苷能以浓度依赖的方式抑制BLCA细胞增殖，并阻断HNRNPA1-K350的乳酸化修饰及其介导的PKM2剪接转换。在体内，虎杖苷治疗显著抑制了肿瘤生长。

结论与讨论

本研究系统阐明了乳酸代谢、蛋白质翻译后修饰和RNA剪接调控在膀胱癌中的新型联系。研究发现并验证了由P300介导的HNRNPA1-K350乳酸化是连接癌代谢重编程（瓦博格效应）和肿瘤恶性进展的关键分子事件。该修饰通过调控PKM基因的选择性剪接，促进PKM2表达，进而增强糖酵解通量，形成一个自我维持的正反馈环路（糖酵解→乳酸↑→HNRNPA1乳酸化↑→PKM2↑→糖酵解↑），持续驱动BLCA的进展。

研究的创新点在于首次将非组蛋白乳酸化与RNA剪接调控联系起来，揭示了代谢物如何直接精细调控基因表达程序的更深层次机制。这不仅深化了对癌症代谢重编程的理解，也为BLCA的诊疗提供了新的潜在靶点。鉴定出的P300-HNRNPA1-K350乳酰化-PKM2轴，以及通过虚拟筛选发现的小分子抑制剂虎杖苷，为开发针对该通路的新型治疗策略奠定了理论基础和实验依据。未来研究可进一步探索乳酸化在肿瘤免疫微环境中的作用，以及靶向此通路与其他治疗方法的联合应用潜力。总之，该研究为理解代谢异常驱动肿瘤发生提供了新的视角，并为膀胱癌的精准治疗开辟了新的方向。