芳香烃受体通过RBX1/HSF1通路缓解急性胰腺炎的作用机制研究

《Journal of Inflammation》：Activation of the aryl hydrocarbon receptor relieves acute pancreatitis via the RBX1/HSF1 pathway

本研究针对急性胰腺炎(AP)中胰腺紧密连接损伤和巨噬细胞M1极化等关键病理环节，探讨了芳香烃受体(AhR)的保护作用及机制。研究人员发现AhR可通过与E3泛素连接酶RBX1结合，促进热休克因子1(HSF1)的泛素化降解，从而减轻胰腺腺泡细胞紧密连接损伤并调控巨噬细胞极化。该研究揭示了AhR-RBX1-HSF1信号轴在AP中的新作用，为AP治疗提供了潜在靶点。

　　

急性胰腺炎(AP)是临床上常见的消化系统急症，其发病率和死亡率一直居高不下。尽管医学技术不断进步，但AP的发病机制尚未完全阐明，缺乏特异性靶向治疗手段仍是临床面临的主要挑战。在AP的早期病理过程中，胰腺上皮紧密连接结构的破坏被认为是关键事件，这种破坏会导致胰腺实质水肿加剧，进而加重病情。因此，探究AP中紧密连接损伤的调控机制，对于开发新的治疗策略具有重要意义。

近年来，芳香烃受体(AhR)作为宿主与环境相互作用的重要调节因子，在免疫和炎症反应中的作用日益受到关注。已有研究表明，AhR信号通路与胰腺损伤存在关联，但其在AP紧密连接损伤中的具体作用尚不清楚。与此同时，热休克因子1(HSF1)作为应激反应的主要转录调节因子，在AP患者中呈现系统性激活状态，可能对残留腺泡具有保护作用。然而，AhR与HSF1之间的调控关系，以及在AP中的作用机制仍有待探索。

在这项发表于《Journal of Inflammation》的研究中，研究人员通过建立严重的AP动物模型和细胞实验，深入探讨了AhR在AP中的作用及其分子机制。研究发现AhR通过调控RBX1/HSF1通路，在缓解胰腺紧密连接损伤和调节巨噬细胞极化方面发挥重要作用，为AP的治疗提供了新的理论依据和潜在靶点。

研究人员主要采用以下关键技术方法：通过重复注射雨蛙素(cerulein)联合LPS注射建立重度AP小鼠模型；使用腺相关病毒(AAV)载体实现AhR的体内过表达；采用组织病理学评分评估胰腺损伤程度；通过免疫组化、Western blot和qRT-PCR等技术检测蛋白和基因表达；利用流式细胞术分析巨噬细胞极化状态；通过Co-IP和泛素化实验验证蛋白质相互作用；使用原代胰腺腺泡细胞进行体外机制研究。

3.1 AHR表达下调与巨噬细胞极化相关

研究人员通过重复雨蛙素注射联合单次LPS注射成功建立了重度AP模型。与假手术组相比，AP组小鼠的胰腺体重比显著升高，血清淀粉酶活性和LDH水平明显上升，胰腺组织中MPO水平增加，提示中性粒细胞浸润加剧。组织学检查显示AP组胰腺组织出现明显破坏，包括小叶结构紊乱、间质充血、出血和凝固性坏死区域，并伴有炎性细胞浸润。更重要的是，AP组胰腺组织中紧密连接相关蛋白claudin 5、occludin和ZO-1的表达显著降低，证实了紧密连接损伤的存在。

通过免疫组化分析发现，AP组胰腺组织中F4/80阳性的巨噬细胞浸润增加，且主要以M1表型为主。值得注意的是，AP组胰腺组织中AhR的表达显著降低，且AhR表达水平与M1巨噬细胞比例呈负相关，与M2巨噬细胞比例呈正相关。同时，促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平在AP组显著升高，表明AP小鼠胰腺中的巨噬细胞极化为M1表型，可能与AhR激活受抑制有关。

3.2 AhR过表达通过HSF1信号缓解雨蛙素诱导的腺泡细胞紧密连接损伤

研究发现，AP小鼠胰腺组织和雨蛙素处理的腺泡细胞中HSF1的表达和磷酸化水平均降低。当研究人员在腺泡细胞中过表达AhR后，雨蛙素诱导的AhR和HSF1激活抑制得到显著缓解。更重要的是，AhR过表达明显挽救了雨蛙素诱导的腺泡细胞紧密连接损伤。此外，用AhR过表达的腺泡细胞条件培养基处理胰腺驻留巨噬细胞(PRM)后，M1巨噬细胞极化受到抑制，M2极化得到促进，促炎细胞因子的分泌水平也相应降低。这些结果表明，AhR过表达可能通过激活HSF1信号通路来减轻雨蛙素诱导的腺泡细胞紧密连接损伤和M1巨噬细胞极化。

3.3 AhR通过与RBX1相互作用介导其表达下调

为探究AhR调控HSF1的具体机制，研究人员通过BioGRID和Ubibrowser数据库分析发现，STUB1和RBX1可能是介导AhR与HSF1相互作用的潜在E3泛素连接酶。在AP小鼠胰腺组织和雨蛙素处理的腺泡细胞中，STUB1和RBX1的表达均显著上调，其中RBX1的上调更为明显。AhR过表达可显著恢复雨蛙素诱导的RBX1表达升高。Co-IP实验进一步证实了AhR与RBX1之间存在直接相互作用，表明AhR可能通过结合RBX1来下调其表达。

3.4 RBX1促进HSF1泛素化修饰并诱导其降解

研究人员发现，RBX1过表达可增强雨蛙素诱导的RBX1上调和HSF1失活。Co-IP实验证实了RBX1与HSF1之间的相互作用。使用蛋白质合成抑制剂CHX处理细胞后发现，RBX1过表达损害了HSF1的蛋白质稳定性。当使用蛋白酶体抑制剂MG132处理细胞时，RBX1过表达诱导的HSF1降解被完全逆转。此外，RBX1过表达显著增强了HSF1的泛素化水平，表明E3泛素连接酶RBX1通过促进HSF1泛素化来诱导其降解。

沉默RBX1可显著恢复雨蛙素抑制的HSF1表达和激活，同时增加claudin 5、occludin和ZO-1的表达水平，表明腺泡细胞紧密连接损伤得到缓解。用RBX1沉默的腺泡细胞条件培养基处理PRM细胞后，M1型巨噬细胞比例和促炎细胞因子分泌水平显著降低，M2型巨噬细胞比例明显升高。这些结果证实RBX1通过促进HSF1降解来抑制其表达和激活，从而加剧雨蛙素诱导的腺泡细胞紧密连接损伤和促进M1巨噬细胞极化。

3.5 AhR通过结合RBX1上调HSF1表达缓解腺泡细胞损伤

Co-IP分析显示，AhR过表达后RBX1与HSF1的结合亲和力降低，表明AhR可能与HSF1竞争结合RBX1。AhR过表达显著抑制了RBX1介导的HSF1泛素化。当在AhR过表达的腺泡细胞中同时过表达RBX1时，HSF1蛋白水平和磷酸化的增加被部分逆转。同时，AhR过表达对雨蛙素处理的腺泡细胞紧密连接完整性的治疗作用也被RBX1过表达部分抵消。在PRM细胞中，RBX1过表达显著减轻了AhR过表达抑制的M1巨噬细胞极化和促炎细胞因子分泌，并促进了M2巨噬细胞极化。这些发现表明，AhR通过与其结合RBX1来增强HSF1表达，从而有助于缓解腺泡细胞紧密连接损伤和调节PRM极化。

3.6 AhR过表达通过RBX1/HSF1轴减轻AP小鼠胰腺损伤并保持紧密连接完整性

在体实验中，研究人员通过AAV载体质粒在AP小鼠中过表达AhR，并采用HSF1抑制剂雷公藤内酯(triptolide)抑制HSF1功能。Western blot分析显示，AhR过表达导致AhR蛋白水平上调，HSF1蛋白和磷酸化水平增加，同时RBX1蛋白水平下调。与AP小鼠相比，AhR过表达降低了胰腺体重比，减少了血清淀粉酶活性和LDH水平，减轻了胰腺组织中的中性粒细胞浸润。组织学检查表明，AhR过表达减轻了胰腺组织的水肿、炎性浸润和坏死状况，而雷公藤内酯处理则加重了这些损伤。

更重要的是，AhR过表达保持了AP小鼠胰腺组织中紧密连接的完整性，而雷公藤内酯则破坏了这种完整性。值得注意的是，雷公藤内酯处理抑制了AhR过表达对AP小鼠胰腺损伤的治疗作用，而AhR过表达也在一定程度上缓解了雷公藤内酯对AP小鼠胰腺损伤的加重效应。此外，AhR过表达显著降低了AP小鼠胰腺组织中的巨噬细胞浸润、M1巨噬细胞极化和促炎细胞因子水平，而雷公藤内酯处理则加重了这些情况。这些发现表明，AhR过表达通过RBX1/HSF1信号轴减轻了AP小鼠的胰腺损伤，而HSF1抑制剂雷公藤内酯部分抵消了这种保护作用。

本研究首次报道了AhR激活通过RBX1/HSF1信号通路减轻AP小鼠胰腺紧密连接完整性损伤的作用机制。研究发现AhR通过结合E3泛素连接酶RBX1，促进HSF1的泛素化降解，从而缓解胰腺紧密连接损伤并调节巨噬细胞极化。这一发现不仅深化了对AP发病机制的理解，而且为AP的靶向治疗提供了新的思路。AhR作为一个潜在的治疗靶点，在AP及其他与巨噬细胞极化失调相关的炎症性疾病中具有重要的临床应用前景。

研究的创新之处在于首次揭示了AhR-RBX1-HSF1信号轴在AP中的作用，明确了蛋白质泛素化修饰在AP发病机制中的重要地位。然而，研究也存在一定局限性，例如主要关注了胰腺腺泡细胞中的作用，而对其他胰腺细胞类型（如导管细胞和星状细胞）的影响尚未明确。未来的研究需要更系统地评估AhR-RBX1-HSF1信号通路在不同胰腺区室中的细胞类型特异性功能。

总之，该研究为AP的发病机制提供了新的见解，证实了AhR-RBX1-HSF1信号通路在AP中的重要调控作用，为开发针对AP的新型治疗策略奠定了理论基础。随着对该通路机制的深入研究，有望为AP患者带来更有效的治疗方案。