基于微流控芯片模拟设计的脂质纳米颗粒尺寸调控及其对mRNA递送效率的影响研究

《Journal of Nanobiotechnology》：Size control of lipid nanoparticles via simulation-based design of a microfluidic chip and its effect on mRNA delivery in vitro and in vivo

本研究针对脂质纳米颗粒(LNP)尺寸控制与mRNA递送效率优化问题，通过计算流体动力学(CFD)模拟设计微流控芯片，成功制备了30-270 nm尺寸范围的LNP。研究发现较小尺寸LNP(38 nm)在体外展现更高细胞摄取和转染效率，体内实验表明尺寸可调控器官靶向性：小于100 nm LNP主要靶向肝脏，大于100 nm LNP倾向脾脏蓄积。该研究为mRNA-LNP制剂的精准设计提供了重要理论依据。

　　

在COVID-19大流行中崭露头角的mRNA脂质纳米颗粒(LNP)技术，正在重塑疫苗开发和蛋白质替代疗法的格局。然而，如何精确控制这些纳米载体的物理化学特性，特别是其尺寸参数，始终是制约其疗效优化的关键瓶颈。传统方法往往需要通过改变脂质组成来实现尺寸调控，但这不可避免地会同时改变颗粒的表面特性，使得难以分离出尺寸因素对生物效应的独立贡献。正是为了解决这一核心问题，Kim B.等人发表在《Journal of Nanobiotechnology》上的研究，开展了一项从模拟设计到体内验证的系统性探索。

为开展本研究，团队首先利用计算流体动力学(CFD)模拟优化了聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片的混合效率，通过设定70%混合指数为阈值，预测并实验验证了不同流速条件。采用固定摩尔比例(40:20:39:1)的脂质配方(C12-200/DOPE/胆固醇/C14-PEG₂₀₀₀)包裹mRNA，制备了不同尺寸的LNP。通过动态光散射(DLS)表征颗粒尺寸和分散性，TNS法测定表观pKa，劳丹染色评估膜流动性，溶血实验评估内体逃逸潜力。体外研究在HeLa细胞中进行，通过流式细胞术和荧光显微镜分析细胞摄取，并利用抑制剂研究内吞途径。体内研究则通过静脉和肌肉注射给与ICR CD-1小鼠，利用活体成像系统(IVIS)观察生物发光信号，分析器官分布。

3.1. 用于LNP尺寸控制的微流控器件开发

研究人员设计了一种特殊的微流控芯片，其流体混合区的宽高比为2:3（100:150 μm），水相和乙醇相以45度角汇合。通过CFD模拟，他们精准预测了对应于小(S, ~38 nm)、中(M, ~145 nm)、大(L, ~269 nm)三种目标尺寸LNP的流速条件。模拟结果显示，在不同流速下，流体在进入混合区前即可达到稳定状态，确保了LNP制备过程的重现性。这种基于模拟的设计方法，实现了仅通过调节流速，而不改变脂质组成，即可在较大范围内（30-270 nm）精确控制LNP尺寸。

3.2. LNP的物理化学性质

对所制备的三种LNP进行的系统表征表明，它们均具有较低的多分散指数(PDI < 0.1)和接近中性的Zeta电位。有趣的是，尽管脂质组成完全相同，但不同尺寸的LNP表现出细微的理化性质差异。小尺寸LNP(S-LNP)的表观pKa值(~6.37)略高于中、大尺寸LNP(~6.08)。通过劳丹染色测定的广义极化(GP)值显示，在酸性pH条件下，S-LNP的膜流动性更高。溶血实验进一步证实，在模拟内体酸性环境(pH 5.5)下，S-LNP诱导的溶血活性显著强于其他尺寸的LNP，提示其可能具有更强的内体膜破坏能力。研究人员还首次尝试将奥斯特瓦尔德熟化(Ostwald Ripening)模型应用于LNP形成过程，估算出LNP的自组装常数K约为3.7 × 10⁴，为理解LNP的形成动力学提供了初步的理论框架。

3.3. LNP的体外生物学性能

在HeLa细胞中的评估清晰地展示了尺寸效应：S-LNP携带的mRNA其荧光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)的表达水平均最高。为了深入理解这一现象，研究人员对细胞摄取过程进行了定量分析。流式细胞术和荧光显微镜结果一致表明，S-LNP的细胞摄取速率和总量均显著高于M-LNP和L-LNP。通过使用不同内吞途径的抑制剂（如抑制网格蛋白介导内吞的Pitstop 2），发现无论LNP尺寸大小，其进入细胞的主要途径均为网格蛋白介导的内吞作用。研究人员还将实验数据与一个考虑了膜弯曲刚度和表面张力的理论细胞摄取模型进行了比对。更新后的模型（P_uptake ∝ 1/(R² + α·κ/R² + β·σ)）预测的趋势与实验观察到的尺寸依赖性摄取规律基本吻合，从物理力学角度解释了小尺寸颗粒更容易被细胞摄取的原因。

3.4. 内体逃逸分析

通过免疫荧光染色观察Cy5标记的mRNA与晚期内体标志物LAMP-1的共定位情况，发现不同尺寸的LNP与LAMP-1的共定位程度均很低（皮尔逊系数均低于0.15）。这表明所有尺寸的LNP，可能得益于其含有的C12-200和DOPE成分，都能有效地在内体成熟前逃逸。因此，S-LNP更高的转染效率主要归因于其更高效的细胞摄取，而非内体逃逸能力的差异。

3.5. 小鼠体内验证

体内实验进一步揭示了LNP尺寸对生物分布的决定性影响。静脉注射后，小尺寸LNP(S-LNP)产生的生物发光信号主要集中在肝脏，而随着尺寸增大，信号逐渐向脾脏转移。M-LNP和L-LNP在脾脏的信号强度远高于肝脏（脾/肝比值分别大于10和7）。这表明，尺寸约为100 nm以下的LNP倾向于在肝脏蓄积，而大于100 nm的LNP则显示出明显的脾脏靶向性。肌肉注射实验则显示，基因表达主要局限于注射部位，且S-LNP的信号强度最高，与体外实验结果一致。在注射后6小时，未在淋巴结中检测到明显信号。

本研究通过模拟驱动的微流控芯片设计，成功实现了在固定脂质组成下对LNP尺寸的精确调控，并系统揭示了尺寸作为一个独立变量，对LNP的理化性质、细胞摄取机制、体内分布和靶向性具有深远影响。该研究不仅为mRNA-LNP的理性设计提供了关键的尺寸参数依据，而且提出的理论模型为理解纳米颗粒与生物系统的相互作用提供了新视角。尤其重要的是，研究发现中等尺寸(~145 nm)的LNP能实现高效的脾脏靶向，这为开发用于癌症免疫治疗或脾脏相关遗传性疾病的新型靶向递送系统开辟了道路。