综述：肌萎缩侧索硬化症前沿治疗：分子发病机制在靶向治疗中的作用

《Stem Cell Research & Therapy》：Cutting-edge treatments in amyotrophic lateral sclerosis: the role of molecular pathogenesis in targeted therapies

本综述系统阐述了肌萎缩侧索硬化症（ALS）的分子发病机制（如C9orf72、SOD1基因突变、蛋白错误折叠、氧化应激等）及当前治疗局限，重点探讨了反义寡核苷酸（ASOs）、CRISPR/Cas9基因编辑、干细胞疗法等前沿策略，为开发疾病修饰疗法提供了新视角。

　　

2. 基于不同方面的ALS分类

ALS可根据发病部位、临床表现和遗传突变进行分类。

2.1. 按发病部位分类

ALS主要分为三种类型：肢体起病型、延髓起病型和呼吸起病型。约70-80%的病例为肢体起病型ALS，症状始于上肢或下肢，初期表现为行走困难、绊倒或精细运动任务（如扣衬衫纽扣）困难。症状通常从一条腿开始，肌肉无力和萎缩随时间逐渐影响其他区域。延髓起病型ALS约占20-25%的病例，主要影响吞咽、咀嚼和说话相关的肌肉，其疾病进展通常比肢体起病型更快，早期症状包括构音障碍、吞咽困难和流涎。呼吸起病型ALS较为罕见，占1-3%的病例，始于呼吸困难、疲劳等症状，由呼吸肌无力引起，患者可能在疾病早期，尤其是在劳累后或躺下时出现呼吸衰竭。

2.2. 按临床表现分类

ALS有多种临床表现形式。经典ALS以上下运动神经元（UMNs和LMNs）共同退化为特征，表现为肌肉无力、僵硬和萎缩。原发性侧索硬化（PLS）进展较慢，仅影响上运动神经元，导致进行性痉挛、僵硬和动作迟缓。进行性肌萎缩（PMA）仅影响下运动神经元，引起无力、肌肉萎缩和肌束震颤，部分PMA可能进展为经典ALS。无力腿综合征和无力臂综合征（近端ALS）分别主要影响腿部和肩臂肌肉，进展较慢。眼运动型ALS极为罕见，早期影响眼肌，而分叉手综合征则表现为特定的手部肌肉萎缩模式，主要影响拇指和食指。

2.3. 按遗传突变分类

遗传突变在ALS发展中起着重要作用。C9orf72相关ALS是最常见的遗传原因，常与ALS-额颞叶痴呆（ALS-FTD）相关。SOD1相关ALS是第二常见的遗传原因，具有可变的进展速率。FUS相关ALS多见于年轻患者，多数病例进展迅速。TARDBP相关ALS与下运动神经元为主的表现型相关。此外，由ALS2基因突变引起的ALS2相关和青少年ALS的特征是进展缓慢且在25岁之前发病。

3. ALS发病的分子机制

ALS的分子机制涉及遗传突变、蛋白错误折叠、线粒体功能障碍、氧化应激、兴奋性毒性和神经炎症之间复杂的相互作用，所有这些都导致运动神经元变性和细胞死亡。

多种遗传突变与ALS相关。最常见的C9orf72基因中的六核苷酸重复扩增导致有毒RNA灶的形成、RNA结合蛋白的隔离以及重复相关非ATG（RAN）翻译，从而积累二肽重复蛋白（DPRs），破坏细胞稳态。导致约20%家族性ALS病例的SOD1突变引起蛋白错误折叠、聚集、氧化应激和线粒体功能障碍，最终促进运动神经元死亡。TARDBP（TDP-43）和FUS的突变导致异常蛋白聚集和RNA代谢受损，破坏RNA加工、运输和应激颗粒形成，从而产生神经毒性。其他相关基因，如CHMP2B、TBK1、OPTN、VAPB、FIG4、NEK1、SQSTM1和SPG11，通过影响囊泡运输、蛋白稳态和细胞骨架动力学来影响ALS发病机制。

蛋白错误折叠是ALS的一个标志，导致错误折叠和聚集蛋白的积累，压倒细胞质量控制系统。内质网（ER）中错误折叠蛋白的积累激活未折叠蛋白反应（UPR），这是一种旨在恢复蛋白稳态的应激反应。然而，慢性内质网应激可诱导运动神经元凋亡。蛋白降解途径（包括泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬）的功能障碍通过阻止错误折叠蛋白的清除显著促进疾病进展。C9orf72、OPTN、SQSTM1和UBQLN2中的遗传突变在这些途径中起关键作用并导致神经变性。

线粒体异常在ALS中也起着核心作用，导致代谢功能障碍和神经元能量缺陷。SOD1、CHCHD10和ALS2中的突变破坏线粒体动力学，损害轴突运输，并导致运动神经元能量耗竭。此外，由突变SOD1和功能失调的线粒体产生过量的活性氧（ROS）引起的氧化应激导致蛋白质、脂质和DNA的氧化损伤，进一步加速神经元变性。

兴奋性毒性是ALS病理生理学的另一个主要贡献者，由谷氨酸对运动神经元的过度刺激引起。主要在星形胶质细胞中表达的兴奋性氨基酸转运体2（EAAT2）的功能障碍导致谷氨酸清除受损，引起其积累和NMDA及AMPA受体的过度刺激。这种过度激活增加了运动神经元细胞质钙（Ca²⁺）内流，从而触发促进凋亡和兴奋性毒性的酶促途径。SOD1和TDP-43等蛋白进一步促进钙稳态失调，加剧神经元死亡。

神经炎症在ALS进展中也起着关键作用，由运动神经元、小胶质细胞和星形胶质细胞之间的相互作用驱动。活化的小胶质细胞释放促炎细胞因子，包括肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白细胞介素-1β（IL-1β）和白细胞介素-6（IL-6），以及ROS，这些都有助于神经毒性。正常情况下提供神经营养支持和维持突触稳态的星形胶质细胞在ALS中发生反应性变化，导致炎症介质的释放和谷氨酸清除受损。此外，Fas配体（FASL）途径通过触发半胱天冬酶激活和线粒体功能障碍促进运动神经元凋亡。

运动神经元依赖有效的轴突运输来分配细胞器、运输囊泡和蛋白质；这些机制的损伤与ALS的进展有关。ALS2、VAPB、FIG4、UNC13A和CHMP2B中的突变破坏囊泡运输，损害突触功能和神经元存活。此外，SPG11、PFN1、DCTN和NEFH中的突变引起的细胞骨架异常损害轴突稳定性和完整性，进一步导致运动神经元功能障碍。

几个关键信号通路也参与ALS发病机制，影响神经变性、炎症和细胞应激反应。核因子κB（NF-κB）信号通路的失调有助于慢性神经炎症，加剧运动神经元损伤。调节应激反应、凋亡和炎症的MAPK信号通路在神经元变性中也起作用。钙依赖性途径通过激活涉及BAX、Bcl-2、Bcl-xl、BAD和半胱天冬酶的凋亡相关级联反应促进兴奋性毒性。

4. 药物治疗

尽管ALS尚无治愈方法，但各种治疗旨在减缓疾病进展、管理症状并提高生活质量。

ALS的疾病修饰治疗主要侧重于减缓病程、延迟损伤发生和延长生存期。两种FDA批准的药物，利鲁唑（Riluzole）和依达拉奉（Edaravone），通过靶向与疾病相关的多种病理生理机制在ALS治疗中发挥关键作用。首个获批用于ALS的药物利鲁唑已被证明可适度延长生存期2-3个月。它通过降低谷氨酸释放和阻断兴奋性毒性（即过高的谷氨酸水平过度刺激并损伤运动神经元的机制）起作用。通常口服给药，有可能通过减轻相关损伤来减缓ALS进展，尤其是在早期阶段。依达拉奉是另一种关键药物，于2017年获批，已显示在ALS早期阶段能有效减缓功能恶化。作为一种抗氧化剂，依达拉奉清除自由基并降低显著加速ALS相关神经损伤的氧化应激。虽然不是治愈性药物，但临床研究表明，依达拉奉可以减缓进行日常活动（如行走和其他日常任务）能力的下降。该药物在10-14天内静脉给药，并有规律间隔。尽管这些疗法对部分患者有帮助，但它们并非治愈性的，ALS患者仍会经历运动功能的逐渐下降。

除了疾病修饰疗法，对症治疗对于通过管理随着病情进展而出现的各种症状（如情绪不稳、痉挛、不适和疲劳）来提高ALS患者的生活质量非常重要。巴氯芬（Lioresal）常用于治疗痉挛（一种以肌肉僵硬和不自主收缩为特征的病症）。作为GABA-B受体激动剂，它可降低运动神经元的过度活动，从而缓解肌肉紧张并增强活动能力。同样，替扎尼定（Zanaflex）是一种α-2肾上腺素能受体激动剂，通过阻断脊髓水平去甲肾上腺素的释放来降低肌张力，从而有助于控制痉挛并改善患者执行日常任务的能力。加巴喷丁（Neurontin）常被超说明书用于治疗神经病理性疼痛，这是ALS的常见症状。加巴喷丁通过与突触前电压门控钙通道的α2δ亚基高亲和力结合，从而抑制兴奋性神经递质的释放，能有效缓解神经损伤相关的疼痛。金刚烷胺（Symmetrel）也被超说明书使用，有助于控制ALS患者常见的认知问题和疲劳。据认为，它通过改变NMDA受体和多巴胺的活性来增强认知功能和情绪。假性延髓情绪（PBA）是ALS中另一个令人痛苦的症状，其特征是无法控制地大笑或哭泣。Nuedexta是FDA批准用于治疗PBA的药物，是奎尼丁和右美沙芬的组合。右美沙芬是一种NMDA受体拮抗剂；奎尼丁通过阻止其分解来增强右美沙芬的效果。该组合在控制情绪反应和显著改善ALS患者的情感生活质量方面显示出高效。

疾病修饰疗法和对症治疗共同为ALS患者提供了基本的管理方案，既针对疾病进展，也处理相关症状。新的治疗方法，包括基因疗法、神经保护药物和干细胞疗法，正在持续研究中，未来可能带来更有效的治疗，并有望治愈ALS。

5. 基因治疗方法

如前所述，遗传突变在家族性和散发性ALS中均起着重要作用。基因治疗是一种旨在纠正、替换或调控致病基因的前沿方法。

用于减轻或消除有害基因影响的两种关键策略是基因敲低和基因敲除。基因敲低在RNA水平上瞬时抑制基因表达，通常采用RNA干扰（RNAi）等方法降解或阻断信使RNA（mRNA）。由于这种方法不改变DNA序列，其效果通常是可逆的，使其在研究基因功能以及需要暂时性基因抑制的治疗应用中具有价值。相比之下，基因敲除通过直接改变DNA序列来永久灭活一个基因，通常利用CRISPR-Cas9等基因组编辑工具。这导致产生不可逆的基因功能丧失的突变，导致基因活性的完全和持续缺失。基因敲除对于阐明基因在发育和疾病发病机制中的作用至关重要，并广泛用于稳定疾病模型的生成。

为了增强ALS基因治疗的疗效，必须透彻了解致病基因的生理作用及其致病所涉及的复杂分子通路。因此，开发特异且有效靶向ALS潜在病理机制的方法至关重要。公认的是，在ALS背景下存在不同的基因治疗策略。

5.1. 反义寡核苷酸或RNA干扰

该方法涉及利用小干扰RNA（siRNAs）或反义寡核苷酸（ASOs）在mRNA水平抑制靶基因的表达，从而减少有害蛋白质的合成。ASOs通过在不改变DNA序列的情况下，在RNA水平调节疾病相关基因的选择性剪接，为ALS提供了一种有前景的治疗方法。在该策略中，ASOs被设计为特异性结合前体mRNA并影响剪接过程（该过程决定RNA片段如何组装成成熟转录本）。通过重定向剪接，ASOs可以纠正错误的RNA加工、跳过突变外显子或恢复功能性蛋白质亚型的产生，从而减少导致ALS病理的有毒蛋白质积累。这种方法已成功应用于靶向SOD1和C9orf72等基因，其中ASOs调节剪接或减少有害基因产物，在临床前和早期临床研究中带来改善的分子和临床结果。因此，剪接调节ASOs代表了一种精准医疗工具，通过微调RNA加工来缓解神经变性，从而解决ALS的遗传突变基础。

这些物质可以作为裸露分子、通过病毒载体或利用物理或化学机制（如纳米颗粒）给药，以特异性靶向中枢神经系统（CNS）。两者的一个局限性是尽管通过鞘内（IT）注射显示出有效的CNS分布，但它们无法穿透血脑屏障。直接注射到脑脊液（CSF）（例如通过IT给药）存在局限性，例如在深部脑区药物浓度较低、腰髓区域药物浓度较高，以及可能出现严重副作用。此外，重复IT注射可能带来临床风险，包括感染或脊髓损伤。

如前所述，SOD1突变是ALS的主要原因之一，尤其在亚洲。在ALS中，与SOD1突变相关的神经变性被认为是由多种因素共同引起的，包括氧化应激、小胶质细胞引起的炎症、有毒蛋白质聚集以及线粒体和少突胶质细胞功能障碍。已在SOD1中鉴定出超过170种不同的致ALS突变。许多SOD1突变通过促进错误折叠蛋白的聚集而导致疾病。因此，在动物模型中评估ASOs后，首次人体临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT01041222）使用ASO ISIS 333611对SOD1相关ALS患者进行了IT注射。该试验评估了IT给予ASO ISIS 333611的安全性和有效性，证明其降低了脊髓中的SOD1 mRNA和蛋白质水平，并且受试者耐受良好。随后的I/II期临床试验（标识为NCT02623699）使用了BIIB067/Tofersen ASO的系列浓度，证明最高剂量100mg在降低CSF SOD1浓度方面效果最显著，尤其是在疾病快速进展者中。SOD1蛋白水平的降低在整个12周治疗期间得以维持。由于首次试验参与者招募不足，BIIB067的研究扩展到III期临床试验，涉及72名参与者。结果表明，Tofersen导致CSF中SOD1水平降低和血浆中神经丝轻链浓度降低，表明其在减缓疾病进展方面具有潜在有益影响。进一步的研究（ClinicalTrials.gov: NCT03070119）正在扩展的III期临床试验中进行。

研究表明，C9orf72的致病性源于毒性功能获得机制，这使其成为ASO基因治疗的一个有前景靶点。一项已完成的I期临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT03626012）对具有致病性C9orf72重复扩增的患者进行了ASO BIIB078的IT注射。结果显示安全性高，但无临床疗效。另一种名为WVE-004的ASO目前处于I/II期临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT04931862）中，以评估其安全性和药效学。ATXN2中27-33个CAG重复可使ALS的比值比增加3至6倍。TDP-43细胞质聚集是近乎普遍的ALS标志。ATXN2在RNA依赖性复合物中与TDP-43发生物理结合；多聚谷氨酰胺扩展的ATXN2异常地将TDP-43隔离到应激颗粒中，加速神经毒性。基于此，正在进行的临床试验评估靶向FUS（ClinicalTrials.gov: NCT04768972）和ATXN2（ClinicalTrials.gov: NCT04494256）的ASO疗法。

RNAi策略也正在探索用于其他与ALS相关的基因。例如，临床前研究表明，在存在TDP-43蛋白病变的情况下，降低由ATXN2基因产生的Ataxin-2表达可以改善运动缺陷并提高生存率。这些结果凸显了利用RNAi技术解决一系列ALS表现的潜力。

5.2. CRISPR/Cas9基因编辑

CRISPR技术能够精确修改DNA序列，有可能直接纠正基因组中引起ALS的遗传缺陷。尽管该方法仍处于早期阶段，但为遗传缺陷的持久解决方案带来了希望。该方法的主要目的是纠正突变的DNA，以防止任何异常的下游通路。虽然尚未直接用于改变ALS患者的疾病，但已用于研究以创建疾病的细胞和动物模型。2017年，Gaj及其同事在G93A-SOD1 ALS小鼠模型上进行了一项研究。使用AAV9作为载体递送靶向SOD1基因的sgRNA。CRISPR-Cas9系统有效地将治疗小鼠腰段和胸段脊髓中的突变SOD1蛋白水平降低了超过2.5倍。此外，突变SOD1蛋白的减少导致运动功能改善和肌肉萎缩减轻。随后进行了更多研究，均表明SOD1水平降低和运动神经元存活率提高。例如，一项研究使用了通过CRISPR/Cas9创建的带有SOD1基因突变的人干细胞来源的运动神经元。他们观察到突变运动神经元积累了错误折叠蛋白、出现轴突损伤、显示突触异常并表现出神经传递功能障碍。这些发现突出了SOD1突变对ALS发展中运动神经元的细胞自主性影响。总的来说，这些研究证明了CRISPR系统用于ALS患者个性化治疗的潜力。

尽管CRISPR技术是一种强大的基因编辑工具，但它面临着几个必须仔细应对的重大挑战。一个主要担忧是脱靶效应的发生，即意外的切割或修饰发生在预期靶点以外的基因组位点，可能导致有害突变或必需基因的中断。此外，CRISPR编辑可能诱导基因组不稳定性、细胞毒性和应激反应，包括p53等肿瘤抑制途径的参与。也可能发生更大的遗传重排，如易位或插入，特别是在癌症风险方面引起安全性担忧。伦理和社会问题至关重要，尤其是在涉及生殖系编辑时，因为对胚胎或生殖细胞进行的改变可能被后代遗传，导致不可预测的遗传和社会后果。

5.3. AAV介导的基因治疗

基于腺相关病毒（AAV）的基因治疗代表了解决ALS的一种有前景策略，特别是对于由SOD1基因突变引起的遗传类型。该技术利用AAV载体递送可减少与ALS相关的突变蛋白产生的遗传物质。AAV载体用于将RNAi制剂或其他治疗基因递送至CNS。这些载体具有穿越血脑屏障的能力。UniQure的EPISOD1试验（ClinicalTrials.gov: NCT06100276）正在评估AMT-162，一种用于SOD1-ALS的基于AAVrh10载体的基因治疗。该试验涉及AMT-162的IT给药，其被设计用于使用特定的微小RNA沉默错误折叠SOD1蛋白的表达。目前处于I/II期，该试验主要评估AMT-162的安全性、耐受性和探索性疗效。

神经营养因子（NTFs）已被广泛研究作为ALS的潜在治疗干预措施。病毒载体用于将基因递送到细胞中，特别是用于将NTFs递送到CNS。AAV驱动的神经元衍生神经营养因子（NDNF）过表达在ALS模型中显示出显著效果。在SOD1 G93A ALS模型小鼠中，IT给予AAV-NDNF可增强运动功能、减轻体重损失并延长寿命。该方法还支持了脊髓运动神经元的存活并减少了异常蛋白积累。

总之，AAV载体用于ALS基因治疗的主要局限性包括：难以穿越血脑屏障，需要高剂量；有限的遗传有效载荷容量；降低有效性的免疫反应；以及缺乏精确靶向，导致脱靶效应。这些挑战限制了治疗基因向神经系统高效和安全递送。

5.4. 基于抗体的策略

该方法类似于用于其他神经退行性疾病（其中抗体靶向异常蛋白如β-淀粉样蛋白）的方法。ALS的临床试验正在研究靶向疾病发病机制中关键蛋白的新型抗体干预措施。这些实验性方法旨在延缓疾病进展并改善患者预后。

DPRs是与C9orf72基因扩增（被认为是ALS最常见的遗传因素）相关的一个关键病理特征。这些蛋白质是通过一种称为重复相关非AUG（RAN）翻译的机制产生的。Nguyen等人（2020）的一项研究表明，高亲和力人抗体可以特异性靶向来自C9orf72突变的RAN蛋白，如GA和GP。这些抗体能有效穿越血脑屏障，并附着在C9-BAC转基因小鼠（一种ALS模型）大脑中的RAN蛋白聚集体上。此外，一项研究调查了ALS患者对HERV-K（HML-2）的抗体反应。ALS患者的脑、脊髓和CSF样本经常显示HML-2转录本和蛋白水平升高，特别是病毒包膜（Env）蛋白。HML-2 Env蛋白具有神经毒性；因此，用特异性抗体阻断Env或抑制其与神经元CD98HC/β1整合素受体的相互作用，可在实验模型中拯救神经元。研究人员发现，与健康对照者和多发性硬化患者相比，ALS患者对HML-2包膜蛋白的抗体反应更强。较高的HML-2 DNA水平和更广泛的抗体反应与疾病持续时间相关。有趣的是，ALS患者中特定HML-2抗体水平较低与更明确的诊断和生存期缩短相关，表明对HML-2的抗体反应可能对ALS具有预后价值。

一项IIA期临床试验（ClinicalTrials.gov: NCT04322149）展示了一项评估抗CD40L抗体Tegoprubart在ALS患者中的安全性和耐受性的研究结果。Tegoprubart表现出剂量依赖性靶点参与，显著降低了与ALS炎症相关的CD40L和CXCL13水平。这种促炎生物标志物的减少，加上未发生任何与药物相关的严重不良事件，提示了潜在的治疗益处。

6. 主要干细胞疗法

细胞疗法的出现基于这样一种关键认识：许多疾病是由于特定细胞群的不可逆损失或功能障碍造成的，而传统的药物或手术治疗往往效果不足。细胞疗法最初概念化于20世纪初，旨在通过引入能够再生或功能补偿的活细胞来修复或替换受损组织。细胞培养技术、组织工程和分子生物学的进步促进了体细胞的分离、扩增，以及最近的重新编程。这些创新极大地拓宽了基于细胞的干预措施的治疗前景。这种范式转变对于解决以内源性再生能力有限为