大麻素受体CB2前向运输新机制：配体作为药理分子伴侣调控细胞表面表达及其功能意义

《Cellular and Molecular Life Sciences》：Insights into cannabinoid receptor 2 (CB2) anterograde trafficking and pharmacological chaperoning

本研究针对CB2受体在细胞表面与胞内分布调控机制不清的问题，系统探究了多种CB2配体对其前向运输的调控作用。研究发现，持续给予CB2激动剂和反向激动剂均可通过药理分子伴侣作用，促进新合成CB2受体向细胞表面运输，且该过程依赖于高尔基体运输和新蛋白合成。这一发现揭示了CB2受体运输的新调控机制，为靶向CB2的炎症性疾病治疗策略提供了新思路。

　　

大麻素受体2(CB2)作为G蛋白偶联受体(GPCR)家族的重要成员，主要表达于免疫细胞，在调节免疫细胞迁移、趋化、分化及细胞因子合成中发挥关键作用，被认为是治疗慢性炎症性疾病（如骨质疏松症、炎症性肠病和神经退行性疾病）的潜在靶点。与传统认知不同，近年研究发现GPCR不仅存在于细胞膜，在未受刺激的细胞中也存在显著的细胞内表达，并可通过细胞通透性配体激活启动非经典信号传导。CB2受体正是如此，在永生化细胞系和人类原代免疫细胞中均有相当比例存在于细胞内。这种亚细胞分布的差异可能直接影响受体功能输出，因此阐明CB2受体亚细胞分布的调控机制至关重要。

目前，关于CB2受体内化及循环过程已有较多研究，但其前向运输（即从合成部位到细胞表面的过程）及亚细胞分布调控机制尚不明确。尤其引人深思的是，亲脂性配体能否作为“药理分子伴侣”与细胞内受体相互作用，协助其正确折叠并促进其向细胞表面运输？这一问题对理解CB2受体功能调控及开发靶向药物具有重要意义。为此，来自奥克兰大学等机构的研究团队在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了最新研究成果，系统揭示了CB2受体前向运输的新机制。

本研究主要采用了免疫细胞化学方法（包括区分检测残留起始表面表达和净表面表达的两种抗体标记策略）、蛋白质印迹分析、cAMP检测（使用CAMYEL生物传感器）以及放射性配体结合实验等关键技术方法。通过构建稳定和瞬时表达野生型及突变型CB2受体的HEK293细胞模型，结合多种药理学抑制剂，深入探究了配体对CB2受体运输的影响。

CP 55,940激动剂刺激诱导CB2同时发生内化和前向运输

研究人员首先比较了两种免疫细胞化学方法（Method A检测残留表面受体，反映内化；Method B检测净表面表达，反映内化与新输送的净效应）在检测CB2对CP 55,940响应时的差异。发现3小时CP 55,940刺激后，Method A显示浓度依赖性CB2内化，而Method B在高浓度时显示表面表达减少不明显甚至无变化。两者差异提示，尽管CP 55,940引起表面CB2内化，但同时刺激了非细胞表面来源的CB2向质膜输送。时间进程实验表明，CP 55,940诱导的CB2前向运输在刺激1小时后开始显著，并持续增加。此现象为CB2特有，在CB1或β₂-AR中未观察到。

双赖氨酸‘KK’基序是CB2基础表面输送所必需，但不是CP 55,940诱导的前向运输所必需

为探究调控CB2运输的分子基序，研究人员构建了C末端尾的突变体：ETE^339-41ATA、KK^318-9EE和截断最后12个氨基酸的Δ12。发现KK突变完全消除了基础表面表达，但不影响总表达，表明该突变阻碍了受体向细胞表面的组成型输送，而非导致快速内化。重要的是，CP 55,940能浓度依赖性地“挽救”KK突变体的表面表达，且此诱导的输送最大程度与野生型相当，但效力约低1个对数单位。抗体“喂养”实验进一步证实KK突变体在无刺激条件下缺乏组成型表面输送。

hCB2 wt和KK突变体拥有相同的成熟状态但比例不同，且激动剂刺激改变成熟状态

蛋白质印迹分析显示，CB2 wt和KK突变体均存在多条分子量条带。KK突变体中≥67 kDa的物种比例基线高于野生型。CP 55,940刺激使野生型和KK突变体的≥67 kDa物种比例减少，而~40至~55 kDa物种比例增加，提示配体可能促进受体从大分子复合物中释放和/或发生翻译后修饰，进而向细胞表面输送。

CP 55,940诱导的CB2前向运输不需要常见的信号通路

为检验信号传导是否参与CP 55,940诱导的CB2表面输送，研究人员使用了多种信号通路抑制剂（PTX、Gallein、U73122、LY294002、GF109203X）。结果表明，这些抑制剂不影响CP 55,940诱导的CB2内化或前向运输，说明该过程不依赖于G_i/o、Gβγ、PLC、PI3K或PKC信号。

CP 55,940诱导的CB2前向运输被高尔基体输出、囊泡酸化和蛋白质合成抑制剂所阻断

使用布雷菲德菌素A(BFA)抑制高尔基体蛋白分泌、莫能菌素(Monensin)中和酸性细胞器腔室pH、以及放线菌酮(CHX)抑制蛋白质合成，发现它们均不影响CP 55,940诱导的内化，但BFA完全阻断了CP 55,940诱导的野生型和KK突变体的前向运输；莫能菌素部分阻断（野生型）或完全阻断（KK突变体）；CHX部分阻断（野生型）或显著减弱（KK突变体）。此外，BFA存在时，CP 55,940引起总CB2表达显著增加，提示配体在分泌途径中增强了受体稳定性。

CB2前向运输由大麻素激动剂、拮抗剂和反向激动剂诱导

研究人员扩展了配体筛选，包括结构多样的激动剂（HU308、WIN 55,212-2、Δ⁹-THC、AEA、2-AG）和反向激动剂（AM630、SR144528）。除2-AG外，其他激动剂和反向激动剂均能诱导CB2前向运输，且效力相对于其内化效力低约75-200倍。Δ⁹-THC虽不引起内化，但能显著增加净表面表达。反向激动剂诱导的KK突变体表面表达进一步证实其前向运输效应。2-AG未诱导前向运输可能与其实验浓度下效力不足有关，且MAGL抑制剂JZL184处理未能改变此结果。

本研究系统阐明了CB2受体前向运输的新机制。基础条件下，CB2表面输送依赖于C末端尾部的双赖氨酸(KK)基序；而多种亲脂性CB2配体（包括激动剂和反向激动剂）能作为药理分子伴侣，通过不依赖于G蛋白信号传导的方式，促进新合成的CB2受体从分泌途径释放并输送至细胞表面。该过程需要高尔基体运输和新蛋白质合成，并伴随受体成熟状态的改变。这一发现不仅深化了对CB2受体生物学特性的理解，更重要的是，揭示了配体结合可直接调控受体合成后运输和亚细胞分布的新层面。考虑到细胞内与质膜CB2可能介导不同的信号传导，配体对CB2分布的动态调控可能深刻影响其功能输出，尤其在炎症等病理过程中。此外，研究结果对CB2靶向药物的研发具有重要启示：配体的膜通透性及其药理分子伴侣活性可能成为药物优化的重要考量因素，以期实现更精准的疗效调控。未来在内源性表达CB2的细胞中验证此现象，并解析其具体的分子伴侣机制，将为进一步开发靶向CB2的免疫调节疗法开辟新的道路。