ALKBH5通过m6A去甲基化修饰SE-lncRNA ZMIZ1-AS1促进FGFR1介导的骨肉瘤增殖和侵袭转移

《Cellular and Molecular Life Sciences》：ALKBH5 demethylation modification of SE-lncRNA ZMIZ1-AS1 promotes FGFR1-mediated proliferation and invasive metastasis in osteosarcoma

本研究针对骨肉瘤转移机制不清、缺乏有效靶点的难题，聚焦超级增强子相关长链非编码RNA ZMIZ1-AS1的功能与调控机制。研究人员发现转录因子FOSL1驱动ZMIZ1-AS1转录，m6A去甲基酶ALKBH5通过去甲基化稳定ZMIZ1-AS1 RNA；ZMIZ1-AS1与PTBP1结合促其胞质转位，进而稳定FGFR1 mRNA。体内外实验证实该轴促癌，联合抑制ALKBH5（ALKBH5-IN-5）和FGFR1（BGJ398）可协同抑制肿瘤生长与转移，为骨肉瘤治疗提供了新靶点与策略。

　　

骨肉瘤是儿童和青少年中最常见的原发性恶性骨肿瘤，以其快速生长和侵袭性进展为特征。尽管手术和化疗取得了进步，但早期诊断困难、转移率高以及治疗耐药性等问题，导致患者预后仍然不佳。因此，深入探索骨肉瘤发生发展的分子机制，寻找新的治疗靶点，对于开发更有效、更精准的治疗方案至关重要。

近年来，表观遗传调控，特别是超级增强子（Super-Enhancer, SE）和RNA修饰（如m⁶A修饰），在肿瘤中的作用日益受到关注。超级增强子是基因组上具有超强转录激活能力的调控元件簇，能够驱动关键癌基因的表达。长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）是一类长度超过200个核苷酸、通常不编码蛋白质的RNA分子，它们通过多种机制参与基因表达调控，在肿瘤进程中扮演着重要角色。由超级增强子驱动的lncRNA（SE-lncRNA）已成为一类重要的肿瘤调控因子。与此同时，m⁶A（N⁶-methyladenosine）作为真核生物信使RNA上最丰富的内部化学修饰之一，其动态可逆的修饰过程由“书写器”（writer）、“擦除器”（eraser，如ALKBH5）和“阅读器”（reader）蛋白共同调控，影响RNA的稳定性、剪接、转运和翻译等多个环节，与肿瘤的发生发展密切相关。

尽管已有研究提示SE-lncRNA和m⁶A修饰在骨肉瘤中可能具有重要作用，但两者之间的交叉调控网络，特别是其如何协同驱动骨肉瘤恶性进展的具体机制，尚不清晰。成纤维细胞生长因子受体1（Fibroblast Growth Factor Receptor 1, FGFR1）作为已知的癌基因，在骨肉瘤中高表达并促进其进展，但其上游的精细调控机制，尤其是是否受到SE-lncRNA和m⁶A修饰的联合调控，仍有待阐明。

为了解决这些问题，研究人员在《Cellular and Molecular Life Sciences》上发表了他们的最新研究成果。他们旨在揭示一个名为ZMIZ1-AS1的SE-lncRNA在骨肉瘤中的功能、调控机制及其下游信号通路，并评估靶向该信号轴的治疗潜力。

为开展本研究，研究人员运用了多种关键技术方法。他们从医院获取了骨肉瘤患者组织样本及配对癌旁组织，并培养了人成骨细胞系hFOB 1.19和多种骨肉瘤细胞系（如U2OS, HOS, 143B, MG-63）。研究涉及生物信息学数据库（如SEdb2.0, GEO, TCGA）分析以筛选候选分子和进行生存分析。基因操作方面，使用了小干扰RNA（siRNA）和短发夹RNA（shRNA）进行基因敲低，以及过表达质粒进行基因过表达。分子机制探究采用了染色质免疫共沉淀（ChIP）-qPCR、双荧光素酶报告基因检测、RNA免疫共沉淀（RIP）、RNA Pull-down、m⁶A甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）-qPCR、蛋白质印迹（Western blot）、实时荧光定量PCR（qPCR）、荧光原位杂交（FISH）、免疫荧光（IF）、免疫组化（IHC）以及放线菌素D处理下的RNA稳定性检测。细胞功能实验包括集落形成、EdU掺入、Transwell迁移和侵袭实验。此外，还通过裸鼠皮下成瘤和尾静脉注射肺转移模型进行体内功能验证，并使用了ALKBH5抑制剂ALKBH5-IN-5（18l）和FGFR抑制剂BGJ398（infigratinib）进行药效评估。数据分析均经过严格的统计学处理。

1. 新型SE相关LncRNA ZMIZ1-AS1在骨肉瘤中被鉴定

研究人员首先利用SEdb2.0数据库分析了骨肉瘤细胞系中的SE相关基因，通过与正常成骨细胞比较，筛选出114个骨肉瘤特异性SE相关基因，其中40个被归类为SE相关的lncRNA。通过生存分析结合临床样本验证，他们发现ZMIZ1-AS1在骨肉瘤组织和细胞系中均显著高表达，且其高表达与患者不良预后和远处转移相关。通过分析H3K27ac（超级增强子的标志性组蛋白修饰）的ChIP-seq数据，并利用ChIP-qPCR和双荧光素酶报告基因实验，证实ZMIZ1-AS1位点存在一个功能活跃的超级增强子区域（包含E1-E6等多个组分增强子），驱动其高表达。

2. 转录因子FOSL1通过超级增强子驱动ZMIZ1-AS1表达

为了探究是何因素驱动了ZMIZ1-AS1相关的超级增强子活性，研究人员通过数据库分析和实验验证，发现转录因子FOSL1（FOS Like 1）能够结合到ZMIZ1-AS1的超级增强子区域（特别是E1, E2, E5, E6）。FOSL1本身在骨肉瘤中高表达，且与ZMIZ1-AS1表达呈正相关。功能实验表明，上调或下调FOSL1能相应改变ZMIZ1-AS1的表达水平，并影响其超级增强子组分的活性。使用超级增强子抑制剂THZ1或JQ1可以逆转FOSL1过表达引起的ZMIZ1-AS1上调。这些结果证明FOSL1通过结合并激活超级增强子来驱动ZMIZ1-AS1的转录。

3. ZMIZ1-AS1促进骨肉瘤细胞增殖、迁移和侵袭

为了明确ZMIZ1-AS1的生物学功能，研究人员在骨肉瘤细胞中进行了功能获得和功能缺失实验。结果表明，敲低ZMIZ1-AS1显著抑制了骨肉瘤细胞的增殖（通过EdU和集落形成实验证实）、迁移和侵袭能力（通过Transwell实验证实）；而过表达ZMIZ1-AS1则产生相反的促癌效果。这证明ZMIZ1-AS1在体外具有促进骨肉瘤恶性表型的作用。

4. ALKBH5通过m⁶A修饰增加ZMIZ1-AS1的转录后稳定性

接下来，研究人员探讨了ZMIZ1-AS1的转录后调控机制。他们预测并证实ZMIZ1-AS1 RNA上存在多个m⁶A修饰位点。与正常组织相比，骨肉瘤中ZMIZ1-AS1的m⁶A修饰水平降低。进一步分析发现，m⁶A去甲基酶ALKBH5在骨肉瘤中高表达，且与ZMIZ1-AS1表达正相关。功能实验显示，ALKBH5能够通过其去甲基化活性，降低ZMIZ1-AS1的m⁶A修饰水平，从而增强其RNA稳定性（通过放线菌素D实验证实），进而上调ZMIZ1-AS1的表达。这表明ALKBH5在转录后水平正向调控ZMIZ1-AS1。

5. ZMIZ1-AS1与PTBP1相互作用改变PTBP1的亚细胞定位

为了探究ZMIZ1-AS1发挥功能的分子机制，研究人员预测并验证了其可能结合的RNA结合蛋白（RBP），发现多嘧啶区结合蛋白1（Polypyrimidine Tract Binding Protein 1, PTBP1）是其主要相互作用蛋白。PTBP1在骨肉瘤中高表达且与不良预后相关。RNA免疫共沉淀（RIP）和RNA Pull-down实验证实了ZMIZ1-AS1与PTBP1之间存在直接结合。有趣的是，ZMIZ1-AS1并不影响PTBP1的总表达量，但能促进PTBP1从细胞核向细胞质的转位（通过免疫荧光和细胞组分分离Western blot证实）。这表明ZMIZ1-AS1通过直接结合改变了PTBP1的亚细胞分布。

6. ZMIZ1-AS1以PTBP1依赖的方式促进FGFR1稳定性

鉴于细胞质中的PTBP1可以调控靶mRNA的稳定性，研究人员进一步探索了ZMIZ1-AS1/PTBP1轴的下游靶标。通过数据库分析和实验验证，他们发现FGFR1是潜在的关键下游分子。RIP和RNA Pull-down实验证实PTBP1能直接结合FGFR1 mRNA。功能实验表明，ZMIZ1-AS1过表达能上调FGFR1的mRNA和蛋白水平，并延长FGFR1 mRNA的半衰期，而这种效应在敲低PTBP1后被消除。此外，敲低FGFR1可以逆转ZMIZ1-AS1过表达所诱导的促增殖、迁移和侵袭作用。这证明ZMIZ1-AS1通过招募PTBP1至细胞质，进而稳定FGFR1 mRNA，从而发挥其促癌功能。

7. ZMIZ1-AS1通过调控PTBP1/FGFR1轴促进体内肿瘤生长和肺转移

为了验证上述机制在体内的作用，研究人员构建了裸鼠模型。结果显示，过表达ZMIZ1-AS1能显著促进皮下移植瘤的生长和尾静脉注射后的肺转移。对肿瘤组织的分子分析表明，ZMIZ1-AS1过表达组的肿瘤中，PTBP1的胞质分布增加，FGFR1的表达水平也显著上调，与体外实验结果一致。

8. 联合抑制ALKBH5和FGFR1协同抑制ZMIZ1-AS1驱动的肿瘤生长和转移

基于上述机制，研究人员评估了靶向治疗策略。他们发现，单独使用ALKBH5抑制剂ALKBH5-IN-5（18l）或FGFR抑制剂BGJ398（infigratinib）均能抑制ZMIZ1-AS1过表达骨肉瘤细胞的活力。更重要的是，两种抑制剂联合使用时表现出显著的协同抗肿瘤效应。在动物模型中，联合用药比单药治疗能更有效地抑制ZMIZ1-AS1驱动的肿瘤生长和肺转移。分子水平上，18l处理增加了ZMIZ1-AS1的m⁶A修饰并降低其稳定性，而BGJ398直接抑制FGFR1活性，联合用药从不同层面阻断了致癌信号通路。

综上所述，本研究系统性地揭示了一条在骨肉瘤中由超级增强子驱动的致癌信号轴：转录因子FOSL1激活超级增强子，驱动lncRNA ZMIZ1-AS1的转录；m⁶A去甲基酶ALKBH5通过去甲基化修饰增强ZMIZ1-AS1的稳定性；ZMIZ1-AS1在细胞质中与PTBP1结合，促进其从核内转位至胞质；胞质PTBP1进而结合并稳定癌基因FGFR1的mRNA，最终促进骨肉瘤的增殖、侵袭和转移。这项研究不仅深化了对骨肉瘤发病机制的理解，特别是超级增强子、lncRNA、m⁶A修饰和RNA结合蛋白之间复杂的调控网络，更重要的是，提出了靶向ALKBH5/ZMIZ1-AS1/PTBP1/FGFR1轴作为骨肉瘤潜在治疗新策略，尤其是联合抑制ALKBH5和FGFR1展现出良好的协同抗癌前景，为未来开发针对ZMIZ1-AS1高表达骨肉瘤患者的精准疗法提供了重要的理论依据和实验证据。