冷冻保存的人类耳蜗神经元球体能够自主组装，用于功能性连接分析及长期耳毒性评估

《Advanced Science》：Cryopreserved Human Otic Neuronal Spheroids Self-assemble for Functional Connectivity Analysis and Long-term Ototoxicity Evaluation

螺旋神经节再生模型与耳毒性药物敏感性研究。通过冷冻保存人多能干细胞前耳板状体细胞，建立了稳定且可重复的耳神经元球体（hONS）生成体系。hONS成功分化出成熟的双极神经元，具备功能性谷氨酸受体介导的钙信号动态，并能在耳蜗外毛细胞和皮质类器官共培养中形成双向突触连接。实验显示hONS对顺铂和链霉素高度敏感，短时低剂量暴露即可引发细胞凋亡和突触退化，长期暴露导致不可逆神经损伤。该模型为耳聋再生治疗和药物安全性评价提供了新型工具。

　　螺旋神经节神经元（Spiral Ganglion Neurons, SGNs）是内耳中至关重要的组成部分，它们在听觉功能中发挥核心作用。这些神经元通过与耳蜗毛细胞（Hair Cells, HCs）形成突触连接，将声音信号传递至大脑的耳蜗核，是听觉系统感知声音的关键桥梁。然而，SGNs一旦受到不可逆的损伤，会导致永久性的感音神经性听力损失（Sensorineural Hearing Loss, SNHL），目前尚无有效的再生方法。因此，SGNs的再生成为解决听力损失问题的重要研究方向。随着人类多能干细胞（Human Pluripotent Stem Cells, hPSCs）技术的发展，研究人员开始探索通过hPSCs生成SGN样神经元的可能性，以期为再生医学和药物筛选提供新的工具。尽管已有相关研究取得了一定进展，但这些方法在可重复性、功能成熟度和操作复杂性方面仍面临挑战。

本研究提出了一种新的方法，利用冷冻保存的hPSC来源的前耳囊外胚层（Pre-placodal Ectoderm, PPE）细胞，构建人类耳蜗神经样球体（Human Otic Neuronal Spheroids, hONS）。这一方法不仅能够保持PPE细胞的高纯度和分化效率，还能够在无需原始hPSC的情况下，实现SGN样神经元的高效生成。通过系统性实验，研究人员发现，这些hONS能够形成具有功能性突触连接的三维结构，表现出特定的分子标记、电生理活性、AMPA受体介导的谷氨酸响应以及广泛的神经突延伸。这些特性使得hONS成为研究SGN生物学和再生机制的理想模型。

此外，研究人员还评估了hONS对耳毒性药物的敏感性。以顺铂（Cisplatin）为例，发现短期低剂量（10 μM）顺铂暴露会导致hONS的细胞凋亡和突触蛋白表达减少，而长期暴露（10 μM，长达12周）则会引发更严重的神经元损伤，包括突触退化和细胞死亡。与之相比，传统的小鼠模型对低剂量顺铂的反应较弱，这表明hONS具有更高的敏感性，更接近人类生理条件。在另一项实验中，研究团队发现，与钠硫代硫酸盐（Sodium Thiosulfate）共同处理能够有效减轻顺铂引起的损伤，进一步验证了hONS在耳毒性药物筛选中的应用潜力。同时，hONS对另一种耳毒性药物——新霉素（Neomycin）也表现出高度敏感性，显示出其在评估多种耳毒性物质方面的广泛适用性。

在功能性方面，研究人员利用微电极阵列（MEA）和钙成像技术，评估了hONS的电生理特性。实验结果表明，hONS在受到谷氨酸刺激后，能够产生与成熟神经元相似的电活动，包括稳定的静息膜电位、可被TTX抑制的动作电位以及具有同步性的神经网络活动。这些发现不仅证实了hONS的成熟度，也表明其能够模拟真实的听觉信号传导过程。通过将hONS与小鼠耳蜗基底膜（mBM）和人类皮层类器官（hCO）共同培养，研究人员进一步验证了hONS在形成双向功能性突触连接方面的能力。这种连接不仅在形态学上具有代表性，而且在功能上也得到了验证，如通过光遗传学刺激和MEA记录所观察到的神经信号传递。

在分子机制层面，研究人员利用转录组学分析，将hONS与人类胎儿耳蜗转录组数据进行对比，发现hONS在基因表达模式上与真实的SGN具有高度相似性。通过整合单细胞RNA测序数据，研究团队还识别出hONS中与SGN相关的关键基因表达特征，包括与突触形成和神经元发育相关的基因。这一结果进一步支持了hONS在模拟人类SGN生物学方面的可靠性。此外，研究还发现，SEMA6D这一信号分子在SGN突触导向中起着重要作用，其表达水平的降低会显著抑制神经突的延伸，这为理解SGN的发育机制提供了新的视角。

本研究的意义在于，它不仅为SGN的再生研究提供了一个可重复、稳定且功能成熟的体外模型，还为耳毒性药物的筛选和保护策略的验证开辟了新的路径。通过将hONS与多种实验技术结合，研究人员能够动态观察神经突的形成过程，并评估其在不同环境条件下的功能表现。这种方法的优势在于，它避免了传统方法中对连续hPSC培养的依赖，从而提高了实验的可控性和可重复性。同时，由于hONS能够在不同批次间保持一致的分化效率和功能特征，这使得该模型在临床前研究中具有更高的应用价值。

尽管hONS在实验室条件下表现出良好的功能特性，但将其应用于体内环境仍面临挑战。目前的研究表明，SGNs在体内具有复杂的相互作用网络，包括与胶质细胞和周围组织的动态联系。因此，未来的研究需要进一步探索如何在体内环境中维持这些神经网络的完整性，以确保hONS能够有效再生并恢复功能。此外，该模型还需在更广泛的耳毒性药物测试中进行验证，以评估其在实际应用中的准确性和特异性。

从应用角度来看，hONS模型为听力损失的治疗策略提供了重要的研究工具。它不仅可以用于评估药物对SGN的毒性作用，还可以作为研究SGN再生机制的基础平台。通过这一模型，研究人员能够更深入地理解SGN在发育过程中的分子机制，并探索可能的再生路径。此外，hONS还能够模拟SGN在不同环境下的反应，为个性化医疗和精准治疗提供数据支持。

总的来说，本研究通过冷冻保存技术，成功建立了hPSC来源的PPE细胞生成hONS的新方法，为SGN的体外研究和再生医学提供了可靠的工具。该模型不仅在形态学和功能上与真实SGN高度相似，还在耳毒性药物的筛选和保护策略的验证中展现出独特的优势。未来的研究可以进一步优化该模型，探索其在体内环境中的再生潜力，并拓展其在药物开发和临床前研究中的应用范围。