巨噬细胞中的吞噬作用驱动的多胺代谢在卵巢癌化疗后增强了癌干细胞的富集

《Advanced Science》：Efferocytosis-Driven Polyamine Metabolism in Macrophages Enhances Cancer Stem Cell Enrichment after Chemotherapy in Ovarian Cancer

化疗诱导的胞葬作用通过ODC1-Putrescine-OPN轴促进卵巢癌细胞干细胞富集，抑制efferocytosis可增强化疗敏感性并减少复发。

　　化疗诱导的癌症干细胞（CSCs）富集是上皮性卵巢癌（OC）获得性耐药和复发的关键机制之一。尽管化疗可能通过选择性存活或诱导去分化来富集CSCs，但化疗过程中肿瘤微环境的动态变化及其对CSCs的影响仍不明确。本研究通过单细胞测序和多重免疫组织化学分析，揭示了化疗后efferocytotic巨噬细胞（即吞噬化疗诱导凋亡肿瘤细胞的巨噬细胞）数量增加的现象。这些efferocytotic巨噬细胞与不良预后和CSCs在OC中的关联被发现，它们的条件培养基能够促进OC的干细胞特性。同时，靶向efferocytosis可以抑制CSCs的富集、耐药性以及肿瘤的再生能力。从机制上看，研究显示由efferocytosis驱动的ODC1表达增强，通过整合代谢组学和转录组学，促进了多胺代谢流，尤其是取精胺（putrescine）的增加。取精胺含量的增加导致巨噬细胞中SPP1和OPN的过表达，通过OPN-CD44轴将癌症干细胞性赋予OC细胞。使用ODC1选择性抑制剂治疗可减轻CSCs的富集，使肿瘤对顺铂（cisplatin）更敏感，并限制肿瘤再生。综上所述，本研究显示efferocytosis及其相关的多胺代谢重编程支持化疗诱导的CSCs富集，为解决OC的耐药性和复发提供了新的治疗靶点。

在研究背景中，卵巢癌的治疗面临巨大挑战，这主要是由于其通常在晚期才被诊断，而手术往往难以完全治愈，化疗成为不可或缺的治疗手段。尽管系统性治疗在近年来取得了进展，特别是将贝伐珠单抗和多聚ADP-核糖聚合酶（PARP）抑制剂与传统铂类化疗相结合，但OC患者的5年生存率并未显著改善。尽管近80%的OC患者对初次铂类化疗有反应，但大多数最终会经历肿瘤复发，并逐渐对铂类药物产生耐药性，而这种耐药性复发大多无法治愈。癌症干细胞（CSCs）被认为是癌症复发和耐药性的驱动因素，因为它们具有自我更新、免疫逃逸和化疗抗性等特性。本研究的先前成果表明，化疗后人类和小鼠模型中均出现了卵巢癌干细胞的富集，这表明化疗可能杀灭大部分肿瘤细胞并导致临床缓解，但同时也可能留下CSCs，为未来的复发埋下隐患。因此，阐明化疗期间CSCs富集的机制并开发针对性策略以对抗这一过程对于改善患者的生存至关重要。

近年来的研究表明，化疗后CSCs的富集是由于选择性生存压力和化疗诱导的肿瘤细胞内源性重编程。然而，肿瘤微环境在此过程中的作用仍未得到充分研究。化疗引起的组织损伤激活了组织修复反应，并招募了中性粒细胞、巨噬细胞、成纤维细胞、淋巴细胞和内皮细胞。其中，巨噬细胞参与了组织修复的三个阶段，包括炎症、消退和再生，这凸显了其在肿瘤微环境中的关键作用。在炎症阶段，巨噬细胞迁移到损伤部位以清除死亡细胞；在消退阶段，它们表现出抗炎表型以减轻炎症；在再生和重塑阶段，它们激活干细胞，促进血管生成并重塑细胞外基质以恢复组织稳态。然而，巨噬细胞的干细胞激活功能是否被癌症细胞利用以在化疗下存活并自我更新，从而引发复发，目前尚不明确。

本研究通过整合患者来源异种移植（PDX）模型、单细胞RNA测序（scRNA-seq）、批量RNA测序和多重免疫组织化学（mIHC）分析，发现化疗驱动了一种源自单核细胞的组织修复型巨噬细胞簇的扩增，该簇与卵巢癌患者的不良预后相关。巨噬细胞通常通过吞噬凋亡细胞来促进组织修复，这一过程称为efferocytosis。在化疗诱导的凋亡细胞清除过程中，efferocytotic巨噬细胞表现出与组织修复和免疫抑制相关的功能特征。我们发现，与未接受化疗的对照组相比，化疗后Macro_c2的丰度显著增加，这通过scRNA-seq和bulk RNA-seq去卷积分析得到验证。进一步分析临床样本发现，GSE143897和GSE227100数据集显示，化疗后Macro_c2的标志基因表达也有所增加。此外，在GSE222557数据集中，与TUNEL阳性区域相关的高表达THBS1的巨噬细胞比例也增加了。这些结果表明，Macro_c2可能在化疗后显著扩增。为了探讨这些巨噬细胞在临床中的相关性，我们使用CIBERSORTx对TCGA-OV和GSE49997队列中的患者样本进行了分析，发现高Macro_c2丰度与较差的总体生存（OS）相关，而Macro_c4的丰度则与较好的OS相关，这与CXCL9:SPP1极性一致。进一步分析使用Macro_c2标志基因OPN（由SPP1编码）和巨噬细胞标志CD68发现，OPN+CD68+比值较低的患者表现出显著延长的OS和无进展生存（PFS）。

在研究结果中，我们发现Macro_c2与efferocytotic巨噬细胞表现出相似的表型、基因表达谱和在肿瘤微环境中的定位，从而将Macro_c2归类为efferocytotic巨噬细胞。通过在体外和体内实验中对efferocytosis进行抑制，我们发现阻断这一过程可以抑制肿瘤耐药性、化疗后肿瘤再生以及CSCs的富集。在ID8-HM细胞的腹腔肿瘤模型中，使用UNC2250单独治疗并未影响肿瘤生长。然而，在接受顺铂和紫杉醇治疗的模型中，UNC2250的加入显著降低了肿瘤负荷，尤其是在治疗后第六天，化疗组的肿瘤负荷明显高于化疗联合UNC2250组。化疗后，化疗组的肿瘤迅速再生，而联合治疗组则没有再生现象。此外，UNC2250治疗还减少了腹膜转移病灶中的OPN+细胞数量和CD44水平。在ID8-HM细胞的原位肿瘤模型中，顺铂联合UNC2250的治疗显著抑制了肿瘤生长。免疫组化（IHC）显示，阻断efferocytosis可以降低增殖（Ki67+细胞比例）并增加凋亡（cleaved-caspase3+细胞比例），与顺铂单独治疗相比有显著差异。重要的是，UNC2250治疗也降低了OPN+细胞数量。我们假设化疗耐药性和再生是部分由CSCs的富集驱动的。事实上，UNC2250治疗可以防止ID8-HM肿瘤中CSC标志物（CD44、ALDH1A1、SOX2）的上升。在SKOV3细胞的皮下肿瘤模型中，也观察到了类似的效果，这与ID8-HM模型的结果一致。总体来看，靶向efferocytosis在化疗期间可以抑制肿瘤再生，增强化疗敏感性，并减少CSCs的富集。

在进一步研究中，我们探讨了efferocytosis与CSCs之间的关系，并发现efferocytotic巨噬细胞的条件培养基（CM）能够增强OC细胞的干细胞特性。通过体外实验，我们发现来自efferocytotic巨噬细胞的CM能够增加OC细胞中干细胞基因（如SOX2、ALDH1A1、ALDH1A3）的表达，而阻断efferocytosis的CM则具有相反的效果。此外，efferocytotic CM增加了ALDH+细胞的比例，SOX2水平，CD24?CD44+细胞的比例，以及球体形成能力，而这些效应在efferocytosis抑制剂处理后被逆转。为了进一步验证OC细胞中的干细胞频率，我们进行了极端稀释分析（ELDA），发现efferocytotic CM显著增加了干细胞频率。CSCs通常表现出更强的化疗耐药性。通过MTT实验评估细胞活力，我们发现与使用其他CM相比，OC细胞在efferocytotic CM培养下对顺铂和紫杉醇的IC50值更高，表明efferocytotic CM增强了OC细胞的化疗耐药性。最后，我们使用巨噬细胞CM和efferocytotic CM处理OC的患者来源类器官（PDO），发现efferocytotic CM处理的PDO中CSC标志物的水平显著高于巨噬细胞CM处理的PDO，进一步证实了efferocytosis对OC细胞干细胞性的促进作用。

在探讨efferocytosis诱导的多胺代谢如何促进CSCs富集的过程中，我们发现efferocytosis诱导的多胺代谢与CSCs的富集密切相关。通过分析RAW264.7巨噬细胞在吞噬凋亡卵巢细胞后的代谢物，我们发现其代谢通路发生了显著变化，包括arginine相关代谢的增强。LC-MS分析显示，有134种代谢物上调，115种下调。结合代谢物和基因表达数据的通路分析表明，efferocytotic巨噬细胞中arginine相关通路的活性增加。我们的RNA测序和代谢物分析显示，arginine在RAW264.7巨噬细胞吞噬凋亡细胞后水平下降，而其下游代谢物putrescine、GABA和spermidine则显著增加。此外，与arginine代谢相关的酶，如ARG1、ODC1、ALDH1B1和ALDH7A1，也在RAW264.7巨噬细胞中上调。值得注意的是，通过scMetabolism分析，我们发现arginine相关通路在Macro_c2中表现出更高的活性。这些结果表明，arginine在连续efferocytosis过程中被转化为多胺及其衍生代谢物。其中，ODC1是多胺合成中将ornithine转化为putrescine的关键限速酶。qRT-PCR和Western blot分析验证了ODC1在efferocytotic巨噬细胞中的上调，并且这一上调在使用efferocytosis抑制剂后被逆转。在OC组织中，TUNEL+CD68+细胞的数量与ODC1+CD68+细胞的数量呈正相关，这表明efferocytosis与巨噬细胞中ODC1的上调相关。为了探讨efferocytosis是否依赖于巨噬细胞的多胺重编程来维持CSCs，我们首先分析了ODC1阳性巨噬细胞与OC CSCs之间的相关性。mIHC分析显示，ODC1+CD68+细胞和TUNEL+ODC1+CD68+细胞的数量与OC组织中CD44+ EPCAM+细胞的数量和ALDH1A1水平呈正相关，这表明巨噬细胞的多胺代谢与CSCs之间存在联系。为了测试抑制这一通路是否会影响CSCs，我们对efferocytotic巨噬细胞使用了DFMO（ODC1选择性抑制剂）进行24小时处理，并收集其CM。DFMO处理的CM显著降低了OC细胞中ALDH+细胞的比例，并逆转了efferocytosis诱导的CSC基因上调。ELDA实验进一步证实，DFMO能够阻止efferocytotic CM诱导的CSC频率增加。同样，DFMO处理的CM还能增加OC细胞在顺铂和紫杉醇处理下的凋亡率。此外，我们还敲除了巨噬细胞中的ODC1，并发现ODC1的敲除降低了ALDH+细胞的比例、SOX2水平和CSC频率。因此，我们得出结论：efferocytosis驱动的ODC1和多胺合成的上调是维持CSCs所必需的，而抑制ODC1能够逆转这一效应，将巨噬细胞的多胺重编程与CSCs的富集联系起来。

在进一步的体内实验中，我们测试了抑制ODC1是否能阻止化疗诱导的耐药性、再生和CSCs富集。在ID8-HM卵巢癌模型中，DFMO单独使用并不能有效抑制肿瘤生长。随后，我们对接受顺铂和紫杉醇治疗的小鼠进行了DFMO联合治疗。在化疗期间，所有治疗组均显示出肿瘤生长的抑制，但化疗结束后，仅化疗组的肿瘤迅速再生。IHC结果显示，仅化疗组的肿瘤中OPN+细胞数量和CD44水平显著升高。在皮下肿瘤中，小鼠接受了顺铂±DFMO治疗12天。顺铂+DFMO组的肿瘤体积和重量显著低于顺铂单独治疗组。IHC显示，顺铂+DFMO组的肿瘤中增殖细胞（Ki67+细胞）和OPN+细胞数量减少，而凋亡细胞（cleaved-caspase3+细胞）数量增加。更重要的是，DFMO治疗显著降低了CSC标志物（SOX2、ALDH1A1、CD44）在肿瘤中的水平。这些结果表明，efferocytotic巨噬细胞中由ODC1介导的多胺代谢重编程对于efferocytosis诱导的癌症干细胞性至关重要。

ODC1-putrescine-OPN轴在efferocytotic巨噬细胞中驱动OC细胞的癌症干细胞性。越来越多的证据表明，多胺在调控癌症干细胞性方面起着关键作用。我们研究了巨噬细胞中的多胺代谢如何调节efferocytosis驱动的癌症干细胞性。首先，我们测试了外源性多胺代谢物是否能模拟efferocytotic CM的效果。OC细胞在putrescine、spermidine或GABA的培养下，仅GABA能够增加OVCAR3细胞中ALDH+细胞的比例，而putrescine和spermidine则未对OC细胞的ALDH+细胞比例产生影响。这表明分泌的多胺可能不是OC中CSCs的促进因素。因此，我们假设分泌蛋白可能在调控癌症干细胞性方面起作用。为了测试这一点，我们对OC细胞使用了efferocytotic CM或其超滤后的成分（>3kDa），发现这些成分和CM均能增加OVCAR3和OVCAR8细胞中ALDH+细胞的比例，这表明分泌蛋白可能在其中起作用。

SPP1和CXCL9是肿瘤相关巨噬细胞极性的关键决定因素和指标。我们的数据一致地显示，这些两种极化亚型的巨噬细胞在OC组织中表现出相反的生存关联。令人惊讶的是，化疗后SPP1+巨噬细胞的比例增加。SPP1+和CXCL9+巨噬细胞已被鉴定为吞噬性巨噬细胞。然而，与CXCL9+巨噬细胞相比，SPP1+巨噬细胞无法处理和呈递抗原，这在我们的研究和之前的研究中均得到验证。我们建立了卵巢癌中efferocytosis、多胺代谢和SPP1+巨噬细胞之间的联系，为靶向这类巨噬细胞提供了新的思路。然而，是否可以通过靶向多胺代谢和efferocytosis来减少其他癌症中SPP1+巨噬细胞的比例，仍需进一步研究。

DFMO是一种不可逆的ODC1抑制剂，已被批准用于治疗人类非洲锥虫病。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准DFMO用于治疗具有部分对多模式治疗（包括抗GD2免疫治疗）反应的高风险神经母细胞瘤。我们发现DFMO能够增强顺铂的疗效，并在同源模型中抑制CSCs的富集。为了进一步评估其临床转化潜力，我们使用来源于黏液性卵巢癌的PDX模型，并评估了DFMO与顺铂的联合治疗效果。单独使用DFMO或顺铂在PDX模型中均未能显著减少肿瘤生长，但两者的联合治疗显著抑制了肿瘤进展并降低了肿瘤重量。相应地，IHC显示联合治疗减少了Ki67+细胞比例和OPN+细胞数量，同时增加了cleaved-caspase3+细胞比例。为了进一步探讨治疗下CSCs的富集情况，我们对OC细胞进行了CD44、ALDH1A1和SOX2的免疫组化分析。结果显示，顺铂能够增加这些CSC标志物的水平，而联合治疗则显著降低了它们的水平。这些发现支持了DFMO与顺铂联合治疗能够通过阻止CSCs富集来增强化疗效果的观点。

本研究还探讨了efferocytosis如何通过ODC1-putrescine-OPN轴促进OC细胞的癌症干细胞性。越来越多的证据表明，多胺在调控癌症干细胞性方面具有重要作用。我们研究了巨噬细胞中的多胺代谢如何调节efferocytosis驱动的癌症干细胞性。首先，我们测试了外源性多胺代谢物是否能模拟efferocytotic CM的效果。OC细胞在putrescine、spermidine或GABA的培养下，只有GABA能够增加OVCAR3细胞中ALDH+细胞的比例，而putrescine和spermidine则未对OC细胞的ALDH+细胞比例产生影响。这表明分泌的多胺可能不是OC中CSCs的促进因素。因此，我们假设分泌蛋白可能在调控癌症干细胞性方面起作用。为了测试这一点，我们对OC细胞使用了efferocytotic CM或其超滤后的成分（>3kDa），发现这些成分和CM均能增加OVCAR3和OVCAR8细胞中ALDH+细胞的比例，这表明分泌蛋白可能在其中起作用。

SPP1和CXCL9是肿瘤相关巨噬细胞极性的关键决定因素和指标。我们的数据一致地显示，这些两种极化亚型的巨噬细胞在OC组织中表现出相反的生存关联。令人惊讶的是，化疗后SPP1+巨噬细胞的比例增加。SPP1+和CXCL9+巨噬细胞已被鉴定为吞噬性巨噬细胞。然而，与CXCL9+巨噬细胞相比，SPP1+巨噬细胞无法处理和呈递抗原，这在我们的研究和之前的研究中均得到验证。我们建立了卵巢癌中efferocytosis、多胺代谢和SPP1+巨噬细胞之间的联系，为靶向这类巨噬细胞提供了新的思路。然而，是否可以通过靶向多胺代谢和efferocytosis来减少其他癌症中SPP1+巨噬细胞的比例，仍需进一步研究。

DFMO作为一种不可逆的ODC1抑制剂，已被批准用于治疗人类非洲锥虫病。美国食品药品监督管理局（FDA）已批准DFMO用于治疗具有部分对多模式治疗（包括抗GD2免疫治疗）反应的高风险神经母细胞瘤。我们在体外实验中发现，ODC1的CRISPR敲除在1100种人细胞系中效果并不显著，且ODC1的缺失与DFMO治疗效果无明显关联。一些早期研究证实DFMO能够抑制卵巢癌细胞的增殖并诱导其凋亡。然而，体外与体内的实验结果存在不一致，这提示DFMO在体内的作用机制可能与体外不同。一项研究报道了ODC1缺陷的CD8+ T细胞能够抑制三阴性乳腺癌细胞的生长。在小鼠卵巢癌模型中，DFMO与阿扎胞苷联合使用能够增加肿瘤中的M1巨噬细胞比例并抑制肿瘤生长。我们的研究扩展了这些发现，表明DFMO能够防止化疗诱导的CSCs富集，并在免疫缺陷和免疫健全的卵巢癌模型中克服化疗耐药性。DFMO已知的安全性使其成为与铂类化疗联合使用的有吸引力的候选药物。

在实验方法部分，我们详细描述了用于本研究的实验流程。首先，我们收集了人类样本，并获得了患者的知情同意。所有患者均被病理诊断为原发性卵巢癌，且没有其他恶性疾病或与异常免疫或造血功能相关的疾病。我们从接受手术切除的卵巢癌组织样本中建立了PDX模型，并进行了mIHC分析或生成了患者来源类器官（PDO）。同时，我们还收集了良性妇科疾病患者的血液样本以获得外周血单核细胞（PBMCs）并分离CD14+单核细胞。为了建立PDX模型，我们使用了NVSG雌性小鼠（NOD-Prkdcscid Il2rgtm201(-/-)/V，VIEWSOLID BIOTECH），从卵巢癌患者中获取肿瘤组织，并在无菌条件下将其分割成更小的片段，随后植入小鼠皮下以建立卵巢癌PDX模型。临床信息详见表S1（支持信息）。

随后，我们进行了单细胞测序。在建立PDX模型后，每3天给小鼠注射载体、顺铂（3 mg/kg，MCE，HY-17394）、紫杉醇（10 mg/kg，MCE，HY-B0015）或两者的联合治疗。治疗后，我们收集了皮下肿瘤样本进行单细胞测序。使用Miltenyi Biotec的肿瘤解离试剂盒（130-095-929）和gentleMACS Dissociator（Miltenyi Biotec，130-093-235）对肿瘤组织进行消化处理。将单细胞悬液加载到Chromium微流控芯片上，使用Chromium Single Cell 30 v3化学试剂和10× Chromium Controller（10X Genomics）进行条形码标记。随后，使用Chromium Single Cell 30 v3试剂盒（10X Genomics）进行RNA逆转录和测序文库构建，最后在Illumina NovaSeq平台上进行测序。

在单细胞RNA测序数据处理中，我们使用FastQC（版本0.12.0）评估原始读数的质量，并在必要时去除低质量读数。原始读数通过10X Genomics的Cell Ranger流程映射到参考基因组mm10。使用Seurat（R包版本4.1.1）进行下游分析。排除了检测基因少于500或超过6000的细胞，以及线粒体含量超过20%的细胞。使用SCTransform对文库大小进行标准化。通过Seurat的RunPCA函数进行PCA降维。使用DoubletFinder（版本2.0.3）识别多细胞样本并去除。使用FindNeighbors和FindClusters函数（分辨率为0.1）对细胞进行聚类，并通过RunUMAP进行可视化。使用FindAllMarkers函数识别标记基因。随后，基于标记基因对簇进行注释，包括成纤维细胞（Col1a1、Col1a2、Pdgfra、Dcn、Acta2）、巨噬细胞（Ptprc、Cd14、Ly6c2、Cd68、Lyz2）、内皮细胞（Pecam1、Vwf、Cdh5）、树突状细胞（Ptprc、Cd74、H2-Aa、H2-Ab1、H2-Eb1）和中性粒细胞（Ptprc、S100a8、S100a9、Ly6g、Csf3r）。巨噬细胞被选为后续分析的对象。在标准化和PCA之后，我们使用harmony（版本0.1.0）进行批次效应校正。巨噬细胞在分辨率为0.1的情况下被重新聚类。使用Seurat的FindAllMarkers函数确定子簇的标记基因。所有参数均使用默认值，除非另有说明。结果通过ggplot2（版本3.4.3）、scRNAtoolVis（版本0.0.4）和SCP（版本0.5.1）进行可视化。

多重免疫组织化学（mIHC）分析部分，我们使用了卵巢癌组织芯片的切片，并根据制造商的说明，使用Think color-6 color mIHC试剂盒（Freethinking，FH36100R）进行了抗体孵育。抗体包括anti-EPCAM（ab223582，Abcam，1:1000，RRID:AB_2762366）、anti-CD44（#37259，Cell Signaling Technology，1:500，RRID:AB_2750879）、anti-CD68（ab213363，Abcam，1:1000，AB_2801637）、anti-OPN（ab214050，Abcam，1:1000，AB_2894860）和anti-ODC1（ab270268，Abcam，1:500）进行免疫染色，随后使用TUNEL染色试剂盒（KGA1401-20，Keygen Biotech）进行TUNEL染色。最后，使用DAPI对细胞核进行复染。切片使用切片扫描仪（Pannoramic MIDI；3Dhistech，匈牙利）进行扫描，并通过HALO Highplex FL（Indica Labs；新墨西哥州阿尔伯克基）对图像进行分析。正细胞百分比通过HALO计算。mIHC分析的临床和病理参数详见表S3（支持信息）。

efferocytosis实验部分，我们使用A2780和OVACR3细胞在50 μM顺铂和50 nM紫杉醇下培养48小时以获得凋亡卵巢癌细胞。凋亡卵巢癌细胞与5 μM Did（MCE，HY-D1028）孵育30分钟，随后与巨噬细胞（anti-human CD45-V500，BD，560777，RRID:AB_1937324或anti-mouse F4/80-BV421，Biolegend，123131，RRID:AB_10915556）按5:1的比例共培养24小时或3小时，随后用PBS洗涤三次并刮取细胞以通过流式细胞术分析efferocytosis能力。CD45+和Did+细胞，或F4/80+和Did+细胞被鉴定为efferocytotic巨噬细胞。每项实验至少进行三次生物学重复。所有数据分析均使用FlowJo软件（版本10.4.1）进行。

巨噬细胞条件培养基（CM）的制备部分，我们将巨噬细胞与凋亡卵巢癌细胞按1:5的比例共培养，并在37°C、5% CO2条件下培养24小时。随后，使用PBS洗涤三次以去除凋亡细胞和药物。efferocytotic巨噬细胞在1 mM DFMO（MCE，HY-B0744）下培养24小时，然后使用PBS洗涤三次以去除DFMO。将这些巨噬细胞在无血清RPMI-1640中培养48小时，收集培养基作为卵巢癌细胞的条件培养基。收集的CM通过0.22 mm滤膜（Biosharp，BS-PES25-22-S）过滤，并在?80°C保存。

流式细胞术部分，我们使用流式细胞术检测OC细胞中的干细胞标志物CD44和CD24，使用anti-CD44-FITC（Elabscience，E-AB-F1100C）和anti-CD24-BV421（Biolegend，311121，RRID:AB_10915556）进行检测。CD44+和CD24?的OC细胞被鉴定为OC干细胞。使用ALDEFLUOR试剂盒（STEMCELL Technologies，目录号01700）检测OC细胞中的ALDH活性，并按照制造商的说明进行操作。ALDH+的OC细胞被鉴定为OC干细胞（CSCs）。CD44+和CD24?细胞的比例以及ALDH+细胞的比例均通过流式细胞仪测量。使用anti-OPN（Proteintech，22952-1-AP，RRID:AB_2783651）分析巨噬细胞中的OPN水平。每项实验至少进行三次生物学重复。所有数据分析均使用FlowJo软件（版本10.4.1）进行。

球体形成实验部分，我们使用巨噬细胞CM培养OC细胞，并将其重悬于无血清DMEM/F12培养基中，补充20 ng/mL人EGF（R&D，236-EG）、20 ng/mL人bFGF（R&D，DFB50）和2% B27补充剂（BasoMedia，S440J7），在37°C、5% CO2条件下培养7-14天。干细胞培养基每三天补充一次，最终天数对球体进行计数。每项实验至少进行三次生物学重复。

极端稀释分析（ELDA）部分，我们使用巨噬细胞CM培养的OVCAR8细胞将其重悬于每孔100个、50个、10个和1个细胞，SKOV3细胞重悬于每孔100个、50个、10个和5个细胞，置于96孔超低板（Corning，7007）中，使用球体形成培养基在37°C、5% CO2条件下培养7-14天。最终对球体形成进行评估，并将数据输入ELDA在线软件（http://bioinf.wehi.edu.au/software/elda/）进行CSC频率和统计显著性的分析。

统计分析部分，我们使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析、IC50计算和生存分析。对于所有生存分析，患者被分为低比值和高比值组，依据R包survminer（版本0.5.0）计算的最优截断值。统计显著性通过log-rank（Mantel-Cox）检验确定。对于两组之间的比较，根据数据分布使用Student's t检验或非参数Mann-Whitney U检验。对于多组比较，使用单因素或双因素方差分析（ANOVA），并结合适当的后验检验来评估差异。使用Spearman相关分析评估两个连续变量之间的关系。显著性定义为P < 0.05。数据以均值±标准差（SD）表示，误差条显示SD。所有数据均来自至少三次独立实验。

伦理批准声明部分，本研究得到了华中科技大学同济医学院联合医院伦理委员会的批准（项目编号：[2024]（118）），并获得了所有患者的知情同意。动物实验遵循华中科技大学同济医学院动物护理委员会的指导（批准编号：[2024]4767）。

致谢部分，本项目得到了中国国家自然科学基金的支持（资助编号：82473095给J.C.，82203535给S.D.，82403619给F.Y.，82273481给Y.W.）。我们感谢来自路易斯安那州立大学健康科学中心的Arif Yurdagul, Jr.提供的RNA-序列数据。

利益冲突声明部分，作者声明无利益冲突。

作者贡献部分，Wenhan Li、Feiquan Ying和Xinkai Pang对本研究做出了同等贡献。W.L.、J.C.和S.S.参与了研究的构思。W.L.、F.Y.、T.L.和P.L.开发了实验方法。X.P.、Q.W.、G.L.、Y.G.和X.X.进行了实验调查。L.H.、J.X.、X.L.、X.W.和S.T.负责可视化。S.D.、F.Y.、L.C.和J.C.获得了资金支持。研究由J.C.、Y.Z.、L.C.和Y.W.指导。W.L.和X.P.撰写了原始草稿，J.C.和W.L.负责审阅和编辑。

数据可用性声明部分，本研究中生成的单细胞RNA测序和批量RNA测序数据已公开存档于基因组序列档案（GSA），存档编号为HRA011200、CRA025015和CRA025002。所有其他原始数据可在通讯作者处请求获得。