一种非共价刺激干扰素基因蛋白水解的嵌合体的开发与表征

《ChemMedChem》：Development and Characterization of a Noncovalent Stimulator of Interferon Genes Proteolysis-Targeting Chimeras

STING PROTACs抑制cGAS-STING通路在眼部炎症治疗中的应用，通过非共价催化降解STING蛋白，BH690L显示11.3 nM有效降解浓度，抑制IL-6等炎症标志物。

　　cGAS-STING通路在免疫系统中扮演着至关重要的角色，它能够识别细胞质中的双链DNA（dsDNA），从而激活先天免疫反应。这一通路的异常激活与多种炎症性疾病密切相关，包括自身免疫疾病。因此，抑制cGAS-STING信号传导已成为一种有前景的免疫调节策略。在当前的研究中，科学家们设计并合成了一系列非共价催化STING降解的PROTAC分子，基于已知的二苯基二氢异喹啉类STING抑制剂化学结构，以期为治疗相关疾病提供新的工具。

PROTAC（蛋白降解靶向嵌合体）技术是一种新兴的药物开发策略，通过将目标蛋白与泛素连接酶结合，促使目标蛋白被泛素化并最终通过蛋白酶体降解。这种技术具有显著的优势，因为它能够以催化的方式降解蛋白质，而不需要像传统小分子抑制剂那样持续存在。此外，PROTAC分子通常具有较大的分子量，这使得它们在局部给药时更容易被组织隔离，从而避免对全身免疫系统的广泛抑制。这种特性在眼科疾病治疗中尤为关键，因为眼睛是一个相对封闭的器官，且其血-视网膜屏障能够有效限制药物扩散到全身。

在本研究中，研究人员选择了一种已知的STING抑制剂，即化合物13，作为开发PROTAC的基础。化合物13的细胞外IC50值为84 nM，而在THP-1细胞中其细胞内IC50值却高达11.5 μM，这表明其细胞膜渗透性较差。因此，研究人员希望通过设计PROTAC分子，利用其较大的分子量和催化降解机制，提高STING的抑制效果。为了实现这一目标，他们利用了已知的化合物18的共晶结构，以确定可能的连接点，并选择了CRBN（脑癌蛋白）和VHL（von Hippel-Lindau蛋白）作为泛素连接酶，因为这两种E3连接酶在视网膜中均有表达，且能够有效降解STING。

研究人员通过不同的合成路线，构建了多种基于CRBN和VHL的PROTAC分子。其中，以化合物13的羧酸基团为连接点的PROTAC分子（如BH690L）表现出较高的降解效率，其DC50（半最大降解浓度）为11.3 nM，而Dmax（最大降解水平）为0.67。这一结果表明，BH690L在较低浓度下即可显著降低STING的表达，从而有效抑制炎症反应。相比之下，以t-丁基基团为连接点的PROTAC分子在某些情况下表现较差，这可能与该位置的连接长度和化学性质有关。

为了进一步验证这些PROTAC分子的活性，研究人员进行了多项实验。首先，通过Western blot分析了不同浓度和时间条件下STING的降解情况。结果显示，BH690L在72小时后能够显著降低STING的表达，且其降解效果在较低浓度下（如2 nM）依然存在。这表明，BH690L不仅具有较高的抑制活性，而且在剂量上更为高效，这可能是其优于传统小分子抑制剂的一个关键因素。

此外，研究人员还利用Lumit免疫分析法直接测量了细胞培养上清液中IL-6（白细胞介素6）的水平。结果显示，BH690L和化合物13均能够有效抑制IL-6的表达，尤其是在cGAMP（环鸟苷酸-腺苷酸）诱导的条件下。然而，由于LPS（脂多糖）能够通过非STING依赖的途径激活其他免疫信号通路，因此在LPS刺激下，IL-6的表达水平仍高于对照组。这一结果表明，虽然BH690L能够有效抑制STING介导的炎症反应，但其在某些情况下可能无法完全阻断所有炎症信号的产生。

为了进一步探讨STING降解对下游免疫信号的影响，研究人员还通过Western blot分析了IRF3（干扰素调节因子3）的磷酸化水平。IRF3是STING信号传导的关键因子，其磷酸化会导致干扰素的产生，进而引发炎症反应。实验结果显示，BH690L和化合物13均能够显著降低IRF3的磷酸化水平，且两者之间没有显著差异。这表明，无论是通过抑制还是降解STING，都能有效阻断其下游信号传导。然而，由于降解过程可能涉及更复杂的机制，例如泛素化和蛋白酶体介导的降解，因此需要进一步研究以明确其作用机制。

研究人员还通过NanoBRET（纳米生物发光共振能量转移）实验评估了BH690L的细胞膜渗透性。该实验结果显示，BH690L在完整细胞中无法有效穿透细胞膜，而在细胞膜被破坏后才表现出明显的信号抑制能力。这一发现表明，BH690L的渗透性较差可能是导致其降解效果延迟的原因之一。尽管如此，其在低浓度下依然能够发挥显著的抑制作用，这可能与其非共价催化机制有关。

为了进一步验证BH690L的降解机制，研究人员还测试了其在不同条件下的降解效果。例如，使用蛋白酶体抑制剂MG132或泛素激活酶抑制剂MLN4924，能够显著减弱BH690L诱导的STING降解效果。这一结果支持了蛋白酶体介导的降解机制，并表明BH690L的作用可能涉及多个步骤，包括STING的泛素化、定位到内质网以及最终通过蛋白酶体降解。

此外，研究人员还比较了BH690L与已知的STING抑制剂SP23的活性。SP23是一种共价抑制剂，其作用机制依赖于与STING的共价结合，而BH690L则是通过非共价方式诱导STING的降解。虽然SP23在较短时间内（如24小时）即可观察到STING的降解效果，但BH690L则需要更长的处理时间（如48小时）。这一现象可能与BH690L的渗透性较低有关，同时也可能与泛素连接酶的招募效率有关。

综上所述，本研究成功开发了一种基于化合物13的非共价STING PROTAC分子，即BH690L。该分子表现出较高的STING降解效率，且其非共价催化机制可能使其在治疗某些炎症性疾病方面具有独特的优势。尽管BH690L的渗透性较差，但其在低浓度下依然能够有效抑制炎症反应，这可能与其独特的分子结构和作用机制有关。未来的研究将进一步探索BH690L在不同细胞类型中的作用效果，以及其在体内条件下的应用潜力。此外，研究人员还计划优化PROTAC的连接长度、化学结构和分子刚性，以提高其活性和选择性。这一研究为开发新型的眼科治疗药物提供了重要的理论基础和实验支持，同时也为PROTAC技术在其他疾病治疗中的应用提供了新的思路。