迈向抗疱疹病毒PROTACs：以卡波西肉瘤相关疱疹病毒潜伏相关核抗原为例，评估靶向蛋白质降解所面临的挑战

《ChemMedChem》：Toward Anti-Herpesviral PROTACs: Assessing the Challenges for Targeted Protein Degradation on the Example of Kaposi's Sarcoma-Associated Herpesvirus Latency-Associated Nuclear Antigen

研究设计靶向Kaposi's sarcoma-associated herpesvirus（KSHV）潜伏相关核抗原（LANA）的蛋白降解复合体（PROTAC），通过结合亲核配体和E3泛素连接酶配体，评估化合物结合活性、三元复合物形成及ADME特性。发现化合物10在形成三元复合物方面表现最佳，但存在细胞渗透性不足的问题，提示需进一步优化PROTAC结构以改善生物利用性。

　　### KSHV与LANA蛋白的靶向蛋白降解策略研究

Kaposi's sarcoma相关疱疹病毒（KSHV），又称为人类伽马疱疹病毒8型（HHV-8），是一种与多种恶性肿瘤密切相关的病毒，包括卡波西肉瘤、原发性体液瘤以及多中心Castleman病。KSHV在宿主细胞中具有双重生命周期，包括潜伏期和裂解期。在潜伏感染阶段，病毒基因组以非染色体形式存在于宿主细胞中，并在细胞分裂时确保其遗传物质的正确分配。其中，潜伏相关核抗原（LANA）在这一过程中起着至关重要的作用，不仅负责维持病毒基因组的稳定性，还广泛调控病毒基因的表达，是开发针对KSHV感染的治疗策略的关键靶点。在裂解期，病毒则进入活跃复制状态，生成可感染的病毒颗粒。此阶段的病毒基因表达高度依赖于LANA的存在。

鉴于LANA在病毒生命周期中的重要性，科学家们一直在探索如何有效抑制其功能，以阻止病毒的持续传播和致病性。近年来，一种新型的药物开发策略——靶向蛋白降解（Targeted Protein Degradation, TPD）受到了广泛关注。TPD的核心理念是通过特定的分子结构设计，使目标蛋白被招募至泛素连接酶（E3 ligase）附近，从而在细胞内被泛素化并最终通过蛋白酶体降解。这一方法不同于传统的抑制剂策略，它不仅能够直接靶向蛋白质，还能实现其从细胞内的清除，从而彻底消除其功能。其中，PROTACs（蛋白降解靶向嵌合体）是TPD领域中最具代表性的分子设计之一。PROTACs由两部分组成：一部分能够与目标蛋白（ToI）结合，另一部分则能招募E3泛素连接酶，以促进目标蛋白的降解。这一机制在治疗多种疾病中展现出巨大的潜力，尤其是在针对难以通过传统小分子抑制剂调控的蛋白时。

本研究的重点是开发针对KSHV LANA蛋白的PROTAC分子，以期通过靶向降解该蛋白，达到抑制病毒复制和传播的目的。为此，研究人员基于两种已知的LANA小分子抑制剂设计并合成了一系列PROTAC分子，其中一部分以CRBN（cereblon）为E3泛素连接酶配体，另一部分则以VHL（Von Hippel–Lindau）为配体。为了优化这些分子的性能，研究人员同时调整了连接子（linker）的结构和长度，以提高其在细胞内的稳定性和活性。此外，考虑到这些分子的结构可能超出传统“药物样”（drug-like）标准，因此在设计过程中特别关注了它们的吸收、分布、代谢和排泄（ADME）特性。

在初步的体外实验中，研究人员评估了这些PROTAC分子对LANA的结合能力以及其对LANA与DNA相互作用的抑制效果。通过微尺度热泳（Microscale Thermophoresis, MST）和电泳迁移率变动分析（Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMSA）等方法，他们发现某些PROTAC分子具有较强的结合能力，并在特定浓度下能够有效抑制LANA与DNA的相互作用。其中，基于LANA抑制剂II设计的PROTAC分子表现尤为突出，例如化合物4在50 μM浓度下显示出高达59%的抑制效果，且其结合亲和力（Kd值）也相对较低，说明其在体外具有较高的活性。然而，尽管这些分子在体外表现出良好的结合能力，但在细胞内的实际应用仍面临挑战。

### 三元复合物的形成与蛋白降解

PROTACs的机制依赖于其能够促进目标蛋白与E3泛素连接酶之间的三元复合物（ternary complex）形成。这种复合物的建立是实现蛋白降解的关键步骤。为了验证这一过程，研究人员使用了原生质谱（Native Mass Spectrometry, nMS）技术，以检测是否形成了LANA与E3泛素连接酶之间的复合物。在实验中，他们发现基于CRBN的PROTAC分子（如化合物10）能够显著增强LANA与CRBN之间的相互作用，从而提高三元复合物的形成概率。然而，基于VHL的PROTAC分子未能在实验中观察到有效的三元复合物形成，这可能是由于VHL与LANA之间的相互作用不够强，或者某些分子设计限制了其与E3泛素连接酶的结合能力。

尽管某些PROTAC分子在体外表现出良好的三元复合物形成能力，但在细胞内的实际应用却受到渗透性（permeability）的限制。在使用Caco-2细胞模型进行渗透性测试时，所有合成的PROTAC分子均未能有效穿过细胞膜，这可能是由于其分子量较大或结构不够灵活，导致其在细胞膜上的穿透能力不足。渗透性不足不仅影响了PROTAC分子在细胞内的分布，也限制了其对目标蛋白的降解效果。因此，研究人员认为，渗透性是制约PROTAC分子在细胞内发挥功能的关键因素之一。

为了进一步探讨这一问题，他们分析了不同结构的PROTAC分子在体外的ADME特性。结果表明，基于PEG（聚乙二醇）连接子的PROTAC分子在水溶性方面表现更优，但其代谢稳定性相对较低。这说明，虽然PEG连接子有助于提高分子的水溶性，从而增强其在体内的可溶性，但其可能也影响了分子在体内的稳定性。此外，研究人员还发现，某些PROTAC分子在Caco-2细胞模型中表现出较差的渗透性，这进一步支持了渗透性不足可能是导致其无法在细胞内有效降解LANA的原因之一。

### 优化策略与未来研究方向

在本研究中，尽管某些PROTAC分子在体外表现出良好的结合能力，但它们在细胞内的应用仍面临诸多挑战。其中，渗透性不足是主要的限制因素。为了克服这一障碍，研究人员提出了一些可能的优化策略。例如，可以考虑使用更短的连接子或更灵活的结构设计，以提高分子的渗透性。此外，还可以探索使用更小的分子（如CLIPTACs，即在细胞内通过点击化学反应形成的PROTACs）来提高其在细胞内的活性。另一种可能的解决方案是使用纳米颗粒作为载体，将PROTAC分子递送至细胞内部，从而绕过渗透性障碍。

除了渗透性问题，研究人员还注意到，某些PROTAC分子可能由于缺乏可被泛素化的赖氨酸残基而无法有效诱导目标蛋白的降解。因此，在未来的研究中，需要进一步分析LANA蛋白的结构，以确定是否存在足够的赖氨酸位点供泛素化反应使用。此外，连接子的长度和几何结构也可能影响三元复合物的形成和稳定，因此需要对连接子进行更系统的优化。

在药物开发过程中，除了优化分子结构，还需要考虑其在体内的代谢稳定性。尽管某些PROTAC分子表现出较高的水溶性，但它们在体内的代谢稳定性较低，这可能会影响其在体内的持续作用。因此，研究人员建议在未来的优化工作中，同时关注分子的水溶性、渗透性、代谢稳定性和泛素化能力，以找到最佳的平衡点。

### 实验方法与合成过程

为了合成这些PROTAC分子，研究人员采用了多种化学反应，包括乌尔曼偶联反应（Ullmann reaction）、铃木–米仓偶联反应（Suzuki–Miyaura coupling）、Ohira–Bestmann反应等。这些反应分别用于合成不同的连接子和E3泛素连接酶配体。例如，化合物14和16是通过乌尔曼偶联反应合成的，而化合物23则是通过NaN3与pomalidomide反应得到的。此外，为了构建完整的PROTAC分子，研究人员还使用了铜催化的叠氮–炔环加成反应（CuAAC），将不同的LANA抑制剂部分与E3泛素连接酶配体连接在一起。

在合成过程中，研究人员还注意到，某些分子的合成需要特定的反应条件，如微波辅助反应或高温条件。这些条件可能会影响分子的产率和纯度，因此在实验设计时需要充分考虑反应条件的优化。此外，由于某些分子的合成过程较为复杂，研究人员还采用了一些辅助试剂，如DIPEA（N,N-diisopropylethylamine）和钠亚磺酸钠（NaN3），以提高反应的效率和选择性。

### 结论与展望

本研究展示了针对KSHV LANA蛋白设计和合成PROTAC分子的可行性。尽管某些分子在体外表现出良好的结合能力，但在细胞内的实际应用仍受到渗透性等关键因素的限制。研究人员认为，未来的研究应着重于优化这些分子的结构，以提高其在细胞内的活性。同时，还需要进一步探索其他可能的药物递送方式，如使用纳米颗粒或更小的分子结构，以克服渗透性问题。此外，针对LANA蛋白的结构特性，研究者还需要进一步分析其是否具备足够的赖氨酸残基供泛素化反应使用，并评估不同连接子对三元复合物形成的影响。

总体而言，这项研究为开发针对KSHV LANA蛋白的靶向蛋白降解策略提供了重要的实验基础。尽管目前仍存在一些挑战，但通过进一步的结构优化和实验验证，有望在未来实现更高效的PROTAC分子，从而为KSHV相关疾病的治疗提供新的思路。未来的研究可以结合更先进的药物化学方法和生物技术手段，推动这一领域的进一步发展。