关于使用固体脂质纳米颗粒将薰衣草水醇提取物作为抗氧化剂递送至NMRI小鼠精子中的研究：在处理、冷冻保存和解冻过程中

《Reproductive Medicine and Biology》：On the Use of Solid Lipid Nanoparticles for Delivering Lavender Hydroalcoholic Extract as an Antioxidant to NMRI Mice Spermatozoa During Handling, Cryopreservation, and Thawing

紫草兰水杨醇提取物负载固体脂质纳米颗粒在冷冻保存过程中通过降低氧化应激显著改善小鼠精子存活率、运动能力和DNA完整性，并上调抗氧化酶及基因表达。

　　本研究探讨了含有薰衣草水醇提取物的固体脂质纳米粒（LHE-SLN）在处理、冷冻和解冻NMRI小鼠精子过程中的保护作用和抗氧化效果。研究的主要目标是评估这种纳米系统在提高精子质量方面的能力，包括提升精子的活力、运动能力以及DNA完整性，同时减少氧化应激带来的负面影响。该研究为改善精子保存技术提供了新的思路，并强调了利用纳米载体提高植物提取物生物利用度的潜在价值。

### 研究背景与意义

在生物医学领域，抗氧化剂被广泛认为是减少活性氧（ROS）损害的重要手段。ROS是一类具有高度反应性的分子，包括羟基自由基（OH·）、超氧阴离子（O?·?）和过氧化氢（H?O?）等。这些物质可以破坏蛋白质、核酸、脂肪等生物大分子，从而导致细胞损伤。在精子保存过程中，冷冻和解冻尤为容易引发氧化应激，因为精子本身具有较低的自我修复能力，且其膜中含有大量多不饱和脂肪酸（PUFAs），使得其更容易受到氧化损伤。此外，即使在常温下保存，精子也可能因为氧化应激而出现质量下降的现象。

为了应对这一挑战，研究人员开始探索使用天然来源的抗氧化剂，如植物提取物，来改善精子保存条件。然而，传统方法存在生物利用度低、稳定性差以及需要高剂量使用的问题，这可能带来潜在的毒性风险。因此，寻找一种能有效提高植物提取物稳定性和释放效率的递送系统成为研究热点。固体脂质纳米粒（SLNs）作为一种新型的纳米载体，因其良好的生物相容性、可控的药物释放特性和低毒性，被认为是实现这一目标的理想选择。

### 材料与方法

本研究采用多种方法对LHE-SLN进行了综合评估。首先，通过自组装方法制备了LHE-SLN，并对其物理化学特性进行了分析。这些特性包括粒径、Zeta电位和多分散系数（PDI）。结果显示，LHE-SLN具有均匀的球形结构，平均粒径为235.8±11.06纳米，Zeta电位为?21.7±5.35毫伏，PDI为0.077±0.01，表明其具有良好的稳定性和均一性。

为了进一步确认LHE是否成功负载在SLNs中，研究团队进行了药物负载率（DL）和包封效率（EE）的测定。通过超速离心法和紫外分光光度计，测定了提取物的释放情况，结果显示LHE的释放率在48小时内达到69.19%。药物释放动力学研究采用零级动力学模型、一级动力学模型、Higuchi模型和Korsmeyer-Peppas模型进行拟合，其中Higuchi模型的拟合度最高（R2=0.9176），表明药物释放主要通过脂质基质的扩散机制进行。

为了评估LHE-SLN对精子的影响，研究人员设计了三个实验：处理阶段、冷冻阶段和解冻阶段。在处理阶段，将不同浓度（1.5、3、4.5和10微克/毫升）的LHE-SLN加入到精子培养基中，观察其对精子活力、运动能力和DNA断裂的影响。冷冻阶段则模拟了实际的精子保存条件，将精子与LHE-SLN共同冷冻，并在解冻后评估其各项指标。解冻阶段则通过将精子在不同浓度的LHE-SLN中逐步复苏，进一步分析其在不同阶段的生物行为变化。

在实验过程中，研究人员采用了多种技术手段，包括光镜观察精子运动能力、Eosin染色评估精子活力、凝胶电泳检测DNA完整性，以及Griess试剂测定硝酸盐（NO）的水平。此外，还通过测定超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的活性，评估了抗氧化系统的功能变化。最后，通过定量实时聚合酶链反应（qRT-PCR）分析了与抗氧化和细胞凋亡相关的基因表达水平，包括Sod1、Sod2、Gpx、Cat、Bax、Bcl2和Casp3等。

### 实验结果

在处理阶段，LHE-SLN的加入显著提高了精子的活力和运动能力，并减少了DNA断裂的程度。特别是3微克/毫升的LHE-SLN在处理过程中表现出最佳效果，显著提升了精子的存活率。在冷冻阶段，1.5微克/毫升的LHE-SLN对精子的保护作用最为明显，而10微克/毫升则表现出一定的负面效应。在解冻阶段，4.5微克/毫升的LHE-SLN显著提高了精子的活力和运动能力，而10微克/毫升则在某些指标上出现了不理想的下降趋势。

在抗氧化酶活性方面，所有浓度的LHE-SLN均显著提高了SOD、CAT和GPx的活性，表明其在抗氧化方面具有积极作用。特别是在处理和冷冻过程中，这些酶的活性呈现出明显的增强趋势。而在解冻阶段，某些浓度（如10微克/毫升）反而对酶活性产生了一定的抑制作用，这可能与高剂量抗氧化剂的毒性有关。

在基因表达水平上，LHE-SLN对多种抗氧化相关基因（如Sod1、Sod2、Gpx和Cat）表现出上调趋势，而对促凋亡基因（如Bax和Casp3）则呈现下调效果。然而，当使用高剂量（10微克/毫升）时，促凋亡基因的表达水平反而升高，同时部分抗氧化基因的表达也受到影响。这一现象表明，LHE-SLN在低剂量时具有良好的保护作用，但高剂量可能会引发一些副作用。

此外，NO的浓度在所有处理阶段均有所增加，尤其是在冷冻阶段，其浓度显著上升。NO在精子功能中具有双重作用：低浓度时有助于精子运动和顶体反应，而高浓度时则可能与超氧阴离子结合生成过氧亚硝酸盐，从而对精子造成损害。因此，研究中观察到的NO浓度变化提示了LHE-SLN在不同浓度下的不同作用机制。

### 讨论与分析

LHE-SLN的物理化学特性为其在精子保存中的应用奠定了基础。其较小的粒径（235.8纳米）和低PDI值（0.077）表明其具有良好的分散性和稳定性，从而能够有效保护精子免受氧化应激的伤害。此外，其表面的负电荷（Zeta电位为?21.7毫伏）有助于防止纳米颗粒之间的聚集，从而确保其在体外环境中的持续释放和有效作用。

从药物释放动力学的角度来看，LHE-SLN的释放模式符合Higuchi模型，表明其释放过程主要依赖于脂质基质的扩散机制。这种可控的释放方式能够确保精子在冷冻和解冻过程中持续接触到抗氧化成分，从而发挥更持久的保护作用。这一发现与先前关于植物提取物负载SLN的研究结果一致，进一步验证了SLN作为抗氧化剂载体的可行性。

在精子保护方面，LHE-SLN展现出良好的潜力。特别是在处理和解冻阶段，低浓度的LHE-SLN显著提升了精子的运动能力和存活率，同时降低了DNA断裂率。这表明，LHE-SLN能够有效中和ROS，减少其对精子结构和功能的破坏。此外，LHE-SLN的加入还显著增强了SOD、CAT和GPx的活性，进一步验证了其抗氧化作用。

然而，研究也发现了一些局限性。例如，在某些实验中，部分指标的变化未达到统计学显著性，这可能与样本量较小有关。此外，高浓度的LHE-SLN（如10微克/毫升）在某些情况下表现出负面效应，如促凋亡基因表达的增加和部分抗氧化酶活性的下降。这提示我们，尽管LHE-SLN具有良好的抗氧化能力，但其使用浓度需要严格控制，以避免潜在的毒性风险。

### 结论

本研究的结果表明，LHE-SLN在处理、冷冻和解冻NMRI小鼠精子的过程中表现出良好的抗氧化和保护作用。特别是在1.5微克/毫升的浓度下，LHE-SLN能够有效降低氧化应激，提升精子的活力、运动能力和DNA完整性。这些发现为开发新型的精子保存技术提供了理论依据和实验支持。

然而，研究也指出了一些需要进一步探索的问题。例如，高剂量LHE-SLN可能引发某些副作用，如促凋亡基因的表达增加，这提示我们需要更深入地研究其在不同浓度下的作用机制。此外，样本量的限制也使得部分结果的统计学意义不够明确，因此，未来的研究应扩大样本规模，并采用更严谨的实验设计，以更准确地评估LHE-SLN的长期效果和安全性。

总的来说，LHE-SLN作为一种新型的纳米载体，展现出在精子保护方面的巨大潜力。其独特的物理化学特性、可控的药物释放模式以及良好的生物相容性，使其成为一种理想的抗氧化剂递送系统。未来，随着对LHE-SLN研究的深入，有望开发出更高效的精子保存方案，为生殖医学和生物技术领域带来新的突破。