从不同豆类种子中筛选、纯化并表征具有细胞毒性和抗菌作用的蛋白酶抑制剂

《Legume Science》：Screening, Purification, and Characterization of Protease Inhibitors From Different Legume Seeds With Cytotoxic and Antimicrobial Effects

大豆、牛油果和鹰嘴豆中蛋白酶抑制剂（PIs）的纯化与活性分析显示，不同提取缓冲液（如0.02 M HCl和0.3 M NaCl）影响PIs提取效率。硫酸铵沉淀和DEAE-Sepharose层析结合Sephadex G-50凝胶过滤显著纯化PIs，其中大豆PIs活性最强（IC50=0.282 μg/mL），对HepG2细胞毒性显著；牛油果PIs在HT-29细胞中高浓度时致细胞死亡；鹰嘴豆PIs需更高浓度才有效。干燥PIs对枯草芽孢杆菌有效，但对金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞菌无效。

　　本研究围绕三种埃及豆类种子——大豆（*Glycine max*）、豇豆（*Vigna unguiculata*）和鹰嘴豆（*Cicer arietinum*）中提取的蛋白酶抑制剂（PIs）展开了系统的研究，重点探讨了这些天然产物在抗菌活性和细胞毒性方面的表现。研究过程中，通过不同提取缓冲液和盐析方法对PIs进行了纯化和特性分析，并进一步评估了它们对几种癌细胞系的影响，以及对某些常见细菌的抑制效果。研究结果不仅揭示了PIs在不同提取条件下的表现差异，还为它们在医药、食品和生物技术领域的潜在应用提供了科学依据。

在提取方法方面，研究发现，不同缓冲液对PIs的提取效果存在显著差异。例如，0.02 M盐酸（HCl）对大豆和豇豆的PIs提取效果最佳，而0.3 M氯化钠（NaCl）则更适合鹰嘴豆。此外，通过不同浓度的硫酸铵（Ammonium sulfate）进行沉淀，可以有效富集PIs。研究结果显示，对于大豆和鹰嘴豆，使用90%饱和度的硫酸铵沉淀效果最佳，而豇豆则在60%饱和度时表现出最高的抑制活性。这表明，不同的植物种类对PIs提取方法的选择具有高度的依赖性，需要根据其特性优化提取条件，以获得最佳的提取效果和活性保留。

在纯化过程中，研究采用了DEAE-琼脂糖（DEAE-Sepharose）柱层析法，并结合Sephadex G-50凝胶过滤技术。实验数据表明，使用0.25 M NaCl作为洗脱液时，三种豆类的PIs纯化效果最好，不仅在总活性和特异性活性方面表现出显著提升，还通过进一步的凝胶过滤实现了更高的纯度。其中，大豆的PIs在DEAE-琼脂糖柱上获得的特异性活性最高，达到36.47 × 10^3 U·mg^-1蛋白，而豇豆和鹰嘴豆则分别为30.27 × 10^3和13.03 × 10^3 U·mg^-1蛋白。这些结果进一步表明，PIs的纯化过程在不同植物来源中具有不同的表现，且通过多步骤的纯化可以显著提升其生物活性。

通过电泳分析，研究人员进一步明确了三种豆类PIs的分子量分布。结果发现，大豆PIs的分子量集中在25 kDa，豇豆PIs则在45 kDa附近，而鹰嘴豆PIs的分子量主要为35 kDa。这一发现有助于理解不同来源PIs的结构特征，并为后续的生物功能研究提供分子基础。此外，PIs的分子量与它们的生物活性可能存在一定的关联，例如，某些特定分子量范围内的PIs可能更有效地与靶标酶结合，从而发挥更强的抑制作用。

在细胞毒性方面，研究评估了不同处理方式（非冻干和冻干）的PIs对三种癌细胞系的影响，包括肝癌细胞（HepG2）、肺癌细胞（A549）和结肠癌细胞（HT-29）。结果显示，大豆的冻干PIs在48小时后显著降低了HepG2细胞的存活率，而豇豆的非冻干PIs在高浓度下对HepG2细胞表现出一定的毒性。相比之下，豇豆PIs在较高浓度下对HT-29细胞具有更强的杀伤效果，而大豆和鹰嘴豆的非冻干PIs对A549细胞的影响较小。值得注意的是，某些PIs在高剂量下可能对不同细胞系表现出差异化的毒性，这可能与PIs的种类、浓度以及细胞类型有关。

研究还评估了PIs的抗菌活性，结果显示，所有三种豆类的冻干PIs均能有效抑制* Bacillus subtilis*的生长，但对* Staphylococcus epidermidis*和* Pseudomonas stutzeri*没有明显的抑制作用。这一结果提示，PIs的抗菌效果可能主要针对某些特定的细菌种类，尤其是革兰氏阳性菌。这种选择性抗菌活性可能与其分子结构和电荷特性有关，因为一些PIs可能通过与细菌细胞膜上的带电位点结合，干扰膜的稳定性，从而抑制细菌的生长。这表明，PIs在抗菌领域的应用具有一定的针对性，可能在某些特定的微生物感染治疗中发挥重要作用。

从整体来看，PIs在植物中的分布广泛，其功能多样性使得它们在多种生物学过程中扮演重要角色。例如，它们可能通过抑制蛋白酶活性，减少细胞内的自由基生成，从而降低氧化应激，延缓细胞老化和损伤。此外，PIs在抗癌作用方面也展现出潜在价值，如通过抑制细胞周期、诱导凋亡等机制影响癌细胞的增殖和存活。研究还指出，不同豆类的PIs在抗癌活性上存在差异，这可能与其化学结构、分子量以及活性成分的种类有关。例如，大豆的PIs表现出较高的抗癌活性，而豇豆和鹰嘴豆的PIs则在某些条件下显示出更强的细胞毒性。

研究结果还表明，PIs的提取和纯化方法对最终产物的活性和纯度具有重要影响。通过优化提取条件，如选择合适的缓冲液、调整盐析浓度和采用多步纯化技术，可以获得更高活性的PIs。此外，研究强调了PIs在农业和生物技术中的潜在应用价值，如作为天然的生物农药，用于防治害虫和真菌感染。这些发现不仅为植物蛋白酶抑制剂的研究提供了新的方向，也为开发基于植物来源的天然药物提供了科学依据。

总体而言，本研究揭示了PIs在不同豆类中的提取、纯化和功能特性，为它们在医药、食品和农业领域的应用奠定了基础。同时，研究还指出，不同提取条件和纯化步骤对PIs的活性和纯度有显著影响，这为后续的深入研究提供了重要的参考。此外，PIs在抗菌和抗癌方面的表现差异提示，它们可能具有不同的生物作用机制，值得进一步探索和验证。未来的研究可以结合分子生物学、结构分析和药理学方法，进一步揭示PIs的作用机制，优化其提取和纯化工艺，探索其在临床和工业中的应用潜力。