三倍体牡蛎不育新机制：代谢重编程与线粒体功能障碍导致β型生殖母细胞停滞与生态位细胞功能失调

《Communications Biology》：Metabolic reprogramming and mitochondrial dysfunction underlie β gonia arrest and niche cell dysfunction in sterile triploid oysters

本研究针对三倍体太平洋牡蛎雌性不育的分子机制不清的难题，整合高分辨率空间转录组学（Stereo-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq），构建了不育三倍体牡蛎性腺的空间分子图谱。研究发现β型生殖母细胞（β gonia）存在生殖质mRNA下调、ATP合成受损和过度线粒体自噬，其生态位细胞则通过NOTCH-Hes1a-CCNA2信号通路发生G1期阻滞。此外，生态位细胞与囊泡结缔组织（VCT）细胞间的代谢分区被破坏。该研究为理解多倍体不育提供了新的机制框架，揭示了生殖细胞-体细胞协调在软体动物繁殖中的重要作用。

　　

在生物界，生殖细胞承载着遗传信息传递的重任，其正常发育是物种延续的基础。然而，染色体数目异常（如三倍体）常常导致生殖障碍，即不育性。经典理论认为，三倍体不育主要源于减数分裂过程中染色体分离错误。但太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）却呈现出一个有趣的悖论：雌性三倍体牡蛎的性腺发育阻滞远比雄性严重，但其卵母细胞在体内处于停滞状态，直至体外受精才启动减数分裂，这意味着其不育性不能完全用减数分裂失败来解释。那么，驱动三倍体雌性牡蛎不育的内在分子机制究竟是什么？这一问题长期以来因牡蛎性腺缺乏清晰结构边界、细胞类型鉴定困难而悬而未解。

为了揭开这一谜团，王慧慧、林曦、郑春雪、余红和李琪研究团队在《Communications Biology》上发表了他们的最新研究成果。他们巧妙地结合了前沿的空间转录组学技术（Stereo-seq）和单核RNA测序（snRNA-seq），首次构建了二倍体与不育三倍体雌性太平洋牡蛎性腺的高分辨率空间单细胞转录组图谱，旨在精确解析导致不育的关键细胞类型——β型生殖母细胞（β gonia）的转录调控异常及其与周围支持细胞（生态位细胞）的互作失调。

研究人员主要运用了单核RNA测序（snRNA-seq）和高分辨率空间转录组学（Stereo-seq）技术，对来自中国桑沟湾的二倍体和不育三倍体雌性太平洋牡蛎的性腺组织进行了分析。此外，还辅以定量PCR（qPCR）、原位杂交（ISH）、RNA干扰（RNAi）、双荧光素酶报告基因检测、染色质免疫沉淀（ChIP）、透射电子显微镜（TEM）以及批量转录组数据分析等多种实验和生物信息学方法进行验证。

单核与空间转录组解析牡蛎性腺细胞图谱

研究首先对二倍体（F2n）和严重不育三倍体（F3nβ）雌性牡蛎的卵巢进行了snRNA-seq分析，共分析了约2万个细胞核，并成功鉴定出生殖细胞、生态位细胞、囊泡结缔组织（VCT）细胞、纤毛细胞、内皮细胞、肌上皮细胞和神经元样细胞等7种主要细胞类型。通过将snRNA-seq数据与Stereo-seq生成的空间转录组数据进行整合（使用Cell2location算法），研究人员精确地将这些细胞类型定位到性腺组织的具体空间位置。结果证实，生殖细胞和生态位细胞主要富集于致密的性腺小管内，而VCT细胞则散布于小管之间。定量分析揭示了一个关键现象：与二倍体相比，三倍体（F3nβ）性腺中的生态位细胞数量显著减少。

β型生殖母细胞的生殖质组成缺陷

通过对生殖细胞进行亚群分析，研究人员鉴定出5个转录 distinct 的亚群，其中包括一个完全来源于F3nβ的细胞簇（sn_C1），该簇被定义为β型生殖母细胞（β gonia）。基因表达分析发现，β gonia特异性下调的基因显著富集于细胞质核糖核蛋白颗粒生成、翻译起始和mRNA分解代谢等过程。尤为重要的是，β gonia中多个生殖细胞颗粒（GCGs）的核心组分（如Ddx4（vasa）、TDRD1、SSP、Piwil1、Piwil2和DDX6）表达显著降低。进一步分析表明，一个关键的卵母细胞分化调节因子SOHLH2在β gonia中表达沉默，并且体外实验证明SOHLH2能够特异性激活Ddx4（vasa）的启动子活性。这提示SOHLH2的沉默可能是导致β gonia中GCGs形成缺陷的重要原因。

线粒体能量缺陷与选择性线粒体自噬是β gonia形成的关键驱动因素

研究发现，β gonia中参与三羧酸循环（TCA循环）、脂肪酸代谢和ATP合成的关键基因（如CKMT2、IDH2、ATP5F1A、CS等）表达严重下调，表明其存在严重的线粒体能量生产障碍。伪时序分析显示，β gonia处于一个分化的分支末端，并且该分支上的基因显著富集于“线粒体自噬”通路（如NBR1、GABARAP、JUN等基因上调）。空间转录组数据和干细胞性分析（CytoTRACE）进一步支持β gonia具有较高的干性，且线粒体自噬相关基因在其发育轨迹起始阶段表达最高。透射电镜观察到了β gonia胞质中存在的线粒体聚集体及其嵴的破坏。这些证据共同表明，线粒体功能衰竭和过度激活的线粒体自噬（PINK1介导的途径）形成了“能量缺陷-线粒体功能障碍”的恶性循环，共同推动了β gonia的发育停滞。

NOTCH-Hes1a-CCNA2轴失活与F3nβ生态位细胞G1期阻滞相关

对生态位细胞的深入分析发现，三倍体生态位细胞（F3nβ-Niche）中NOTCH信号通路及其下游靶基因Hes1a表达显著下调。同时，与S期（RRM2）和G2/M期（CCNB2）相关的细胞周期基因，特别是G1/S期转换的关键调控因子CCNA2也明显下调。细胞周期分析证实，高达40.8%的F3nβ-Niche细胞被阻滞在G1期。机制探索表明，Hes1a的表达与CCNA2呈显著正相关。通过RNAi敲低Hes1a，确实导致CCNA2表达下降。双荧光素酶报告基因实验和染色质免疫沉淀（ChIP）实验最终证实，Hes1a能够直接结合到CCNA2基因启动子区的特定顺式调控元件（CRE2）上并激活其转录。因此，NOTCH-Hes1a-CCNA2信号轴的抑制是导致三倍体生态位细胞周期阻滞的重要原因。

生态位与VCT细胞的区室化能量流提示F3nβ中存在谱系特异的营养储备模式

代谢通量分析（Compass）显示，F3nβ-Niche细胞的类固醇代谢通量和TCA循环关键酶活性显著减弱，脂肪酸合成代谢（如β-酮脂酰合酶）也受到抑制。超微结构观察发现，F3nβ-Niche细胞中典型的桥粒样连接、脂滴和内质网结构稀少。与之形成对比的是，F3nβ的VCT细胞则表现出增强的脂质生成以及AMPK/PPAR信号通路激活。细胞间通讯分析进一步揭示，在F3nβ中，β gonia与VCT细胞之间存在显著的GRN（颗粒蛋白前体）信号交流，而生态位细胞作为NOTCH信号发送者（通过DLL1）的调控主导地位则被削弱。这表明，三倍体性腺中体细胞间的代谢分工被破坏，VCT细胞可能通过GRN等信号影响了β gonia的自噬活动，而生态位细胞则因数量减少和功能失调无法提供足够的代谢和信号支持。

综上所述，这项研究系统地阐明了太平洋牡蛎三倍体雌性不育的多层次机制。核心结论是：β型生殖母细胞（β gonia）由于关键转录因子SOHLH2的沉默，导致生殖质颗粒（GCGs）组成缺陷，进而引发线粒体能量代谢障碍和过度线粒体自噬，最终停滞在未分化状态。同时，性腺微环境中的生态位细胞因NOTCH-Hes1a-CCNA2信号轴失活而发生G1期阻滞和数量锐减，其正常的营养供给（如卵黄蛋白原VG）和信号支持功能丧失。而囊泡结缔组织（VCT）细胞的代谢活动则发生重编程，与生态位细胞和生殖细胞间的代谢协同被打破。这项工作不仅为理解软体动物乃至无脊椎动物多倍体不育的复杂机制提供了全新的视角和详实的证据，揭示了生殖细胞与体细胞间精密协调的重要性，也为水产养殖中生殖控制策略的开发提供了潜在的理论基础和靶点。