综述：打破障碍：工程化改造细胞外囊泡以增强其进入内体的能力并实现治疗性递送

《Journal of Controlled Release》：Breaking barriers: Engineering extracellular vesicles for enhanced endosomal escape and therapeutic delivery

外泌体（EVs）作为天然纳米载体，凭借优异生物相容性、免疫逃逸和靶向递送能力，在疾病治疗中展现潜力，但内体逃逸效率低制约其临床转化。本文系统综述表面修饰（如多肽、聚合物）、遗传整合（膜融合蛋白、通道模块）及物理重塑（膜脂组成优化）等工程策略，并探讨先进定量分析技术，强调需突破异质性、规模化及纯度等瓶颈，推动EVs向临床应用转化。

　　EVs（细胞外囊泡）作为一种自然的纳米载体，近年来在生物医学领域引起了广泛关注。与合成纳米颗粒相比，EVs具有更优异的生物相容性、免疫耐受性和组织亲和性。然而，尽管EVs在细胞摄取方面表现出较高的效率，其在临床转化过程中仍面临主要挑战——囊泡在内体中的逃逸效率不足，这限制了其在细胞质中有效递送的功能。为了克服这一障碍，研究者们开发了多种工程策略，包括在分离后对囊泡表面进行修饰、基因整合融合蛋白和通道形成模块，以及通过生物物理手段改造囊泡膜脂质组成。这些策略旨在通过增强膜融合能力和促进内体膜的不稳定化，从而提高EVs的细胞内递送效率。与此同时，先进的定量分析方法的发展使得对内体逃逸效率的评估更加精确。本文综述了近年来在EVs工程方法和分析技术方面的进展，并探讨了未来如何克服生物学和制造过程中的障碍，以实现EVs在临床治疗中的潜力。

在纳米医学的背景下，EVs的使用代表了一种新的方向。纳米医学是指利用纳米技术来预防、诊断和治疗各种疾病，通过纳米尺度的药物制剂实现这一目标。美国食品药品监督管理局（FDA）将纳米药物定义为包含至少一个维度在纳米尺度范围（通常为1–100纳米）的药物，这些材料可能赋予药物独特的化学、物理或生物学特性，这些特性与它们的常规形式不同。根据组成和结构特征，纳米药物涵盖了多种平台，包括脂质体、抗体药物偶联物、无机纳米颗粒、聚合物纳米载体以及EVs。这些系统相较于传统药物具有诸多优势，如改善溶解性和稳定性、增强靶向特异性、可控药物释放特性以及克服生物屏障的能力。因此，纳米药物平台能够递送多种类型的治疗负载，包括小分子、蛋白质和核酸。已有多种基于纳米医学的治疗药物获得FDA批准，这些药物相较于未修饰的药物表现出更优的药代动力学特性和更低的毒性。一个显著的早期例子是Doxil?，这是首个获得FDA批准的纳米药物，它在脂质体药物递送方面取得了重大进展，并为后续的纳米医学发展铺平了道路。

尽管如此，合成纳米药物仍然存在一些局限性，如递送效率低、清除速度快以及由于生物相容性差而引起的毒性问题。为了克服传统纳米载体的这些限制，EVs成为一种有前景的策略。根据MISEV 2023指南，EVs是由几乎所有细胞类型分泌的脂质双层包裹的纳米颗粒，它们不具备自我复制的能力。由于其内源性来源，EVs作为药物递送系统具有多个优勢，包括出色的生物相容性、较低的免疫原性以及内在穿越生物屏障的能力。EVs可以根据操作术语进行分类，如小EVs（< 200纳米）或大EVs（> 200纳米），但由于常见的分离方法导致的分布重叠，严格的尺寸划分并不存在。操作术语也可能反映密度、分子组成或细胞来源。从生物发生学角度来看，EVs包括外泌体（来源于多囊泡体）、ectosomes（来源于细胞膜）以及来自特定过程的EVs，如migrasomes和凋亡体。然而，基于生物发生学的子类型分离和表征仍然存在技术上的挑战，因此这些术语应谨慎使用，并且需要有充分的证据支持。

EVs通过封装和传递来源于其细胞来源的生物分子，成为细胞间通讯的重要媒介。通过这一机制，EVs能够递送广泛的生物负载，包括蛋白质（如生长因子、细胞因子、粘附分子）、脂质（如胆固醇、神经酰胺）以及核酸（如DNA、mRNA、miRNA）。此外，EVs可以通过生物工程手段在其表面展示靶向配体、肽或蛋白质，从而实现组织特异性递送。这种天然的复杂性为工程化EVs提供了独特的平台，使其成为具有治疗潜力的多功能纳米载体。

在比较研究中，EVs在细胞摄取和细胞内运输方面表现出优于合成纳米颗粒的能力。例如，HEK293来源的EVs能够通过丝状伪足高效募集到细胞膜，并迅速被内吞作用摄入，而脂质纳米颗粒（LNPs）则往往聚集在细胞膜表面，摄取有限。使用CRISPR/Cas9组分的功能实验表明，在体外，负载sgRNA的EVs表现出显著高于MC3基LNPs的转染效率。在体内，EVs在递送mRNA和siRNA方面也优于脂质基的合成载体，这可能与其固有的组织亲和性和免疫耐受性有关，如系统给药后诱导的细胞因子减少所证实的那样。虽然递送效率可能因EV来源、剂量和给药途径的不同而有所变化，但越来越多的证据支持EVs在核酸递送和靶向治疗方面相较于传统合成平台具有独特优势。鉴于LNPs目前代表了最先进和广泛采用的合成纳米载体之一，其在mRNA疫苗中的关键作用，直接比较EVs和LNPs凸显了对这两种平台进行并行评估的重要性和临床转化价值。

此外，比较EVs与结构上类似于EVs脂质双层的合成纳米颗粒——脂质体，发现EVs进入细胞的速度更快，且在细胞内积累的效率更高，达到脂质体所需的20–80倍浓度，这一结果通过加载多柔比星的内源性荧光的共聚焦成像得到证实。这种效应可能源于EV表面表达的蛋白质介导的主动内吞作用。在体内研究中，发现通过瘤内给药的EVs能够与肿瘤组织保持更长时间的结合，而脂质体则无法达到这一效果。与这些发现一致，通过共聚焦显微镜和流式细胞术进行的互补体外分析显示，EVs在细胞内摄取效率方面优于脂质体，突显了其在细胞摄取和肿瘤保留方面的增强能力。尽管如此，EVs在临床转化过程中仍需克服多个生物学障碍，这些内容将在后续部分进一步探讨。

为了评估EVs的内体逃逸能力，研究者们开发了多种分析方法。然而，这一过程仍然是EVs为基础的药物递送系统开发中的主要障碍。虽然已有多个研究引入了成像和分析方法来监测这一过程，但尚未建立一个普遍接受的金标准检测方法。为了确认EVs与受体细胞的结合或摄取，研究人员常用脂溶性染料，如Cy5和MemGlow?，这些染料可以标记EV膜蛋白或脂质双层。然而，这些染料的使用可能会影响EVs的生物学特性，因此在评估过程中需要谨慎。此外，为了更准确地测量EVs的内体逃逸效率，研究者们开发了多种定量分析方法，包括使用荧光标记物、生物传感器和高通量筛选技术。这些方法能够提供更精确的评估数据，从而更好地指导EVs的工程化设计。

在EVs的工程化过程中，研究人员通常采用多种策略来增强其内体逃逸能力。这些策略可以分为三个主要类别。首先，分离后表面修饰是在纯化后的EVs上引入功能性成分，如pH响应性或细胞穿透性肽（CPPs）、内体溶解性肽或膜破坏性聚合物，以促进内体膜的不稳定化。其次，基因工程策略涉及在EVs中整合融合蛋白和通道形成模块，以增强膜融合能力。第三，生物物理工程策略通过改变囊泡膜脂质的组成，以优化其与细胞膜的相互作用。这些策略通常需要精确的膜修饰，以确保EVs能够有效地逃逸内体并递送至细胞质中。此外，研究人员还探索了多种策略来增强EVs的内体逃逸能力，包括改变EVs的表面电荷、使用光控释放系统以及开发智能响应性材料。这些策略的结合可能进一步提高EVs的递送效率，使其在临床治疗中更具应用前景。

在评估EVs的内体逃逸能力时，研究人员通常采用多种分析方法。这些方法包括使用荧光标记物、生物传感器和高通量筛选技术，以测量EVs的内体逃逸效率。然而，这些方法在实际应用中仍存在一定的局限性，例如对EVs的检测可能受到荧光淬灭或背景干扰的影响。此外，不同分析方法的灵敏度和特异性可能存在差异，因此在评估过程中需要选择合适的检测手段。为了提高检测的准确性，研究人员正在开发新的分析方法，如基于单分子成像的高分辨率检测技术、结合生物化学和生物物理分析的多模态检测方法以及利用人工智能辅助的自动化分析系统。这些方法的结合可能进一步提高EVs的评估精度，为工程化设计提供更可靠的依据。

在EVs的工程化过程中，研究人员还关注其在不同生物环境中的表现。例如，EVs在不同细胞类型中的摄取效率可能存在差异，这可能影响其在体内的递送效果。此外，EVs的稳定性也可能受到外界环境的影响，如pH值、温度和离子强度的变化。因此，在工程化设计过程中，研究人员需要考虑这些因素，并开发相应的稳定策略，以确保EVs在体内能够保持其功能特性。同时，EVs的制造过程也需要优化，以提高其产量和纯度，从而满足临床应用的需求。这些优化措施可能包括改进分离方法、开发新型培养系统以及采用自动化制造技术。这些技术的结合可能进一步提高EVs的制造效率和质量，为其临床转化提供更可靠的基础。

在EVs的工程化过程中，研究人员还探索了多种策略来提高其在体内的递送效率。例如，通过改变EVs的表面特性，如引入靶向配体或改变表面电荷，以增强其与特定组织的结合能力。此外，研究人员还开发了多种策略来提高EVs的稳定性，如采用新型脂质配方或引入稳定蛋白，以延长其在体内的循环时间。这些策略的结合可能进一步提高EVs的递送效率，使其在临床治疗中更具应用前景。同时，研究人员还关注EVs的生物安全性，以确保其在体内的使用不会引起不良反应。这些安全性评估通常包括对EVs的免疫原性、毒性以及在体内的代谢途径的研究。这些研究的成果可能为EVs的临床转化提供更全面的依据。

在EVs的工程化过程中，研究人员还关注其在不同疾病模型中的应用。例如，EVs在癌症治疗、神经退行性疾病治疗和免疫调节治疗中的表现可能有所不同，这可能影响其在临床中的适用性。因此，在工程化设计过程中，研究人员需要考虑这些因素，并开发相应的治疗策略，以确保EVs能够有效地递送至目标组织并发挥治疗作用。这些治疗策略可能包括结合特定的药物负载、引入靶向配体或改变EVs的表面特性。这些策略的结合可能进一步提高EVs的治疗效果，使其在多种疾病模型中具有更广泛的应用前景。

综上所述，EVs作为天然的纳米载体，具有显著的生物相容性和免疫耐受性，同时在细胞摄取和组织保留方面表现出优于合成纳米载体的能力。然而，其在临床转化过程中仍面临诸多挑战，如内体逃逸效率不足、制造过程中的异质性以及规模化生产的困难。为了克服这些障碍，研究人员正在开发多种工程策略和分析方法，以提高EVs的递送效率和临床应用价值。这些策略的结合可能进一步推动EVs在纳米医学领域的发展，使其成为具有广泛应用前景的治疗工具。