无标记非线性光学显微技术揭示活体组织中细胞代谢与髓鞘动态的奥秘

《Communications Biology》：Label-free nonlinear microscopy probes cellular metabolism and myelin dynamics in live tissue

本研究针对神经退行性疾病中髓鞘代谢耦合机制研究缺乏高时空分辨率活体成像技术的难题，开发了一种结合双光子荧光寿命成像(2P-FLIM)和三谐波产生(THG)的无标记多模态非线性光学显微镜平台。研究人员通过该技术成功实现了对小鼠小脑切片中细胞代谢状态(NAD(P)H)和髓鞘分布的同时动态监测，并建立了自动化图像分析方法。结果揭示了小脑不同细胞类型(浦肯野神经元、少突胶质细胞、小胶质细胞)的特异性代谢特征，并发现脱髓鞘过程中小胶质细胞向糖酵解表型转变，再髓鞘化时恢复。该研究为神经炎症和神经退行性疾病研究提供了强大的无创研究工具，开辟了神经胶质代谢耦合研究的新视角。

　　

在我们的大脑中，神经元和胶质细胞之间存在着精密的代谢协作关系，这种协作对于大脑正常活动和髓鞘可塑性至关重要。髓鞘是包裹在神经轴突外的脂质结构，就像电线的绝缘层一样，能够显著提高神经信号传导速度。然而，在多种神经退行性疾病如多发性硬化症(MS)和阿尔茨海默病中，髓鞘损伤和能量代谢异常是突出的病理特征。理解神经元与胶质细胞之间的代谢耦合机制，特别是在髓鞘形成、脱失和修复过程中的动态变化，对于开发有效的治疗策略具有重要意义。

传统成像技术如磁共振成像(MRI)和正电子发射断层扫描(PET)受限于空间分辨率，难以在微米尺度上捕捉这些过程的复杂空间异质性。而需要标记的显微技术虽然分辨率较高，但外源性标记物可能干扰正常组织功能。因此，开发能够无创、高分辨率地同时监测细胞代谢和髓鞘动态的成像方法成为神经科学领域的迫切需求。

在这项发表于《Communications Biology》的研究中，Bahar Asadipour等研究人员开发了一种创新的无标记非线性光学成像框架，成功实现了对活体组织中细胞代谢和髓鞘分布的同时可视化。该研究不仅建立了先进的成像平台，还开发了配套的图像分析方法，为研究神经退行性疾病中的代谢异常和髓鞘病变提供了强大工具。

研究人员主要采用了以下几种关键技术方法：搭建了结合双光子荧光寿命成像(2P-FLIM)和三谐波产生(THG)的多模态非线性光学显微镜平台；使用小鼠小脑器官型切片作为研究模型，样本来源于8-10天龄的转基因小鼠；开发了基于机器学习的自动化图像分析流程，包括髓鞘轴突分割算法和单细胞代谢特征提取方法；通过荧光寿命phasor分析量化NAD(P)H代谢状态；利用形态学参数(偏心度)评估小胶质细胞激活状态。

Label-free multimodal nonlinear microscopy to probe metabolism and myelin

研究人员构建了一套多模态非线性光学显微镜平台，结合了双光子激发、荧光寿命成像(FLIM)和三谐波产生显微镜(THG)。该系统使用可调谐飞秒激光器，在1150纳米波长下进行THG成像以可视化髓鞘，在760纳米波长下进行NAD(P)H的2P-FLIM成像以评估代谢状态。通过使用表达红色荧光蛋白的转基因小鼠品系，研究人员能够特异性研究少突胶质细胞和小胶质细胞。该平台成功实现了对小脑切片中髓鞘分布和细胞代谢状态的同时无标记成像。

THG microscopy and automatic myelinated axon segmentation probe dynamic changes of myelin distribution

研究团队开发了全自动的工作流程来从THG图像中检测和分割髓鞘轴突。该方法结合了Hessian和Meijering滤波策略，能够准确识别组织中的髓鞘结构。通过定义"髓鞘评分"(myelin score)来量化特定区域内的髓鞘含量，研究人员发现该评分在髓鞘形成过程中逐渐增加，从4天体外培养(4 DIV)到8天体外培养(8 DIV)显著升高。将自动分割结果与手动追踪进行对比验证了该方法的准确性和敏感性，证明自动分割能够检测到更多THG信号较弱的髓鞘节段。

Single-cell endogenous fluorescence analysis reveals metabolic differences between neuronal, oligodendrocytes, and microglia populations

通过单细胞代谢分析，研究人员发现不同细胞类型具有独特的代谢特征。浦肯野神经元显示最长的NAD(P)H寿命和最高的结合NAD(P)H比例，表明其主要依赖氧化磷酸化(OXPHOS)代谢途径。少突胶质细胞具有中等水平的NAD(P)H寿命和结合比例，而小胶质细胞则显示最短的NAD(P)H寿命和最低的结合比例，提示其更倾向于糖酵解或脂肪酸β-氧化代谢。这些代谢差异与各细胞类型的功能需求相一致，神经元需要高效ATP生产支持电活动，而胶质细胞则更需要糖酵解产生的代谢中间体用于生物合成和抗氧化防御。

Single-cell endogenous fluorescence analysis reveals metabolic changes in microglia during demyelination and remyelination

在脱髓鞘和再髓鞘化过程中，研究人员观察到小胶质细胞的代谢状态和形态发生显著变化。脱髓鞘条件下，小胶质细胞呈现更圆形的形态(低偏心度)，同时NAD(P)H寿命和结合比例降低，表明其向促炎表型极化，代谢更倾向于糖酵解。而在再髓鞘化阶段，小胶质细胞恢复为分支状形态(高偏心度)，代谢表型也恢复正常。此外，脱髓鞘组织中小胶质细胞内THG信号增强，可能反映了其对髓鞘碎片的吞噬活性。这些发现表明小胶质细胞的代谢状态与其免疫功能密切相关，在脱髓鞘病理过程中发挥关键作用。

研究结论与讨论部分强调，这项工作首次实现了在活体组织中同时以单纤维分辨率可视化髓鞘和以单细胞分辨率监测代谢状态。所开发的成像框架能够表征脱髓鞘病理过程中的时空异质性，为研究神经胶质代谢耦合如何调节髓鞘可塑性提供了有力工具。研究发现小胶质细胞在脱髓鞘过程中表现出的代谢可塑性和异质性，提示靶向小胶质细胞代谢可能成为治疗脱髓鞘疾病的新策略。

该研究的重要意义在于建立了一种非侵入性的方法，能够长期动态监测神经组织中的代谢和髓鞘变化，这对于理解神经退行性疾病的发病机制和开发治疗策略具有重要价值。未来研究方向包括将多参数代谢成像(结合NAD(P)H和FAD荧光寿命测量)应用于不同细胞类型和组织状态，以及在斑马鱼或小鼠脱髓鞘模型中进行在体纵向研究，进一步揭示炎症和脱髓鞘过程中细胞代谢的时空动力学特征。