下颌形态发生：从进化生物学（EVC）视角探讨错颌的遗传机制

《Journal of Oral Biosciences》：Mandibular morphogenesis: Genetic insights into malocclusion from EVC perspective

本研究调查伊朗马赞达兰地区人群EVC基因rs1383180多态性与下颌骨骼突起的关联。采用病例对照研究（148例对照组，119例下颌前突，126例下颌后缩），通过PCR-RFLP结合Sanger测序进行基因分型，并利用MUpro、ConSurf等工具预测蛋白功能影响。结果显示AA基因型与下颌前突显著相关（p=0.036），突变可能通过破坏Hedgehog信号通路影响骨骼发育。无显著关联于下颌后缩。生物信息学分析提示该变异导致EVC蛋白结构不稳定。

　　这项研究聚焦于探讨一个特定的单核苷酸多态性（SNP）——EVC基因的rs1383180位点（G > A；R > Q）与伊朗北部马赞达兰地区人群中下颌骨骼错颌的关系。研究采用了病例对照设计，结合临床影像学分析与分子遗传学方法，试图揭示该基因变异在下颌发育异常中的潜在作用。

### 研究背景与意义

下颌是人体头骨中最庞大且最强壮的骨骼之一，它不仅构成了下颌结构，还支撑着面部的美学特征，并通过颞下颌关节与颅骨的颞骨相连，从而实现咀嚼、言语和正常的牙齿咬合功能。下颌的形成涉及复杂的骨发育过程，包括软骨内成骨（endochondral ossification）和膜内成骨（intramembranous ossification）两种机制。其中，软骨内成骨由软骨细胞衍生的细胞完成，形成下颌的髁状突颈部和上颌支；而膜内成骨则由骨髓和骨外膜的前体细胞完成，形成下颌体和下颌支的表面结构。值得注意的是，髁状突软骨作为一种次级软骨，其成熟时间晚于四肢和颅底的初级软骨，且紧邻膜内成骨的下颌结构。这种复杂的发育过程使得下颌对机械刺激高度敏感，任何发育异常都可能影响面部整体的协调性。

在临床实践中，下颌与上颌之间的正常关系是维持良好咬合和面部美观的基础。当这种关系出现显著改变时，常表现为骨骼性错颌，即所谓的“错颌”现象。根据下颌位置与上颌的相对关系，这些错颌可以分为三类：第一类（Class I）表示正常的下颌-上颌关系；第二类（Class II）表现为下颌后缩，常见于某些种族群体，尤其是白种人；第三类（Class III）则与下颌前突有关，常导致面部轮廓凹陷，影响外观和功能。研究发现，骨骼性错颌不仅改变了面部形态，还可能对患者的心理和社会适应能力产生负面影响，如降低自信心、影响言语清晰度以及咀嚼困难等。因此，明确影响下颌发育的遗传因素对于理解错颌的病因、制定更精准的治疗方案具有重要意义。

EVC基因位于人类染色体4p16.2区域，编码一种I型跨膜蛋白，其在骨骼发育过程中扮演关键角色。该基因与EVC2蛋白共同作用，形成一种复合体，定位于初级纤毛的基底部分。这种复合体对于Hedgehog（Hh）信号通路的调节至关重要，而Hh信号通路在骨骼形成、组织分化和发育过程中起着核心作用。由于EVC基因在骨骼发育中的重要性，研究者们关注其基因变异对下颌形态的影响。特别是rs1383180这个错义SNP，其在EVC基因中取代了精氨酸（R）为谷氨酰胺（Q），可能对蛋白质的结构和功能产生重要影响。因此，本研究选择该SNP作为研究对象，旨在探讨其在马赞达兰人群中下颌前突（mandibular prognathism）中的潜在作用。

### 研究方法与样本来源

本研究共纳入393名参与者，其中包括148名健康对照者、119名下颌前突患者以及126名下颌后缩患者。所有样本均来自伊朗马赞达兰省巴博尔市的Arash正畸诊所。参与者均未有牙颌创伤或手术史，也未接受过任何正畸治疗。为了确保样本的代表性，研究团队采用了头影测量分析（cephalometric analysis）来分类这些样本，依据Steiner参数（如SNA、SNB、ANB）和“Wits”评估（衡量上下颌在咬合平面上的差异）来确定下颌的发育状态。

头影测量分析是正畸学中常用的评估工具，能够准确反映上下颌的相对位置和骨性关系。研究团队通过专业正畸医生的协助和一个在线平台（https://webceph.com/en/）进行测量和记录。根据标准分类规则，SNA角（上颌基骨与鼻根点之间的角度）在82° ± 2°范围内被认为是正常的；SNB角（下颌基骨与鼻根点之间的角度）在80° ± 2°范围内为正常，若SNB角大于82°则提示下颌前突，小于78°则提示下颌后缩；而ANB角（上颌基骨与下颌基骨之间的角度）在2° ± 2°范围内为正常，若大于4°则提示第二类错颌，小于0°则提示第三类错颌。此外，Wits值用于进一步评估上下颌在咬合平面的差异，男性通常为?1 ± 2 mm，女性为0 ± 2 mm。若Wits值超过+1 mm（男性）或+2 mm（女性），则提示下颌后缩；若低于?3 mm（男性）或?2 mm（女性），则提示下颌前突。

为了确保研究的准确性，只有那些在Steiner参数和Wits评估中一致符合分类标准的样本才被纳入分析。对于存在矛盾或不确定性的样本，则被排除。这一严格的筛选过程有助于减少误差，提高研究结果的可靠性。

### 基因型与等位基因频率分析

研究团队使用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）和Sanger测序技术对rs1383180位点进行了基因分型。PCR-RFLP方法通过特定的限制性内切酶（Kpn2I）对PCR扩增产物进行切割，从而区分不同的基因型。例如，GG基因型产生两个条带（300 bp和265 bp），GA基因型产生三个条带（565 bp、300 bp和265 bp），而AA基因型则仅产生一个未被切割的条带（565 bp）。Sanger测序进一步验证了这些基因型的准确性，确保了实验数据的可靠性。

在基因型频率分析中，研究发现rs1383180的AA基因型与下颌前突存在显著关联（p = 0.036），其相对风险（OR）为2.118，即与GG基因型相比，AA基因型的个体更有可能表现出下颌前突。此外，A等位基因的频率在病例组（下颌前突）中高于对照组，尽管这一趋势未达到统计学显著性（p = 0.081），但仍提示该等位基因可能在某些情况下对下颌前突起到一定作用。相比之下，AA基因型与下颌后缩无显著关联，说明该SNP可能更倾向于影响下颌的过度生长，而非生长不足。

研究还对基因型分布是否符合哈迪-温伯格平衡进行了检验。结果显示，下颌前突病例组的基因型分布偏离了平衡状态，而其他组则符合。这一偏离可能暗示了某种选择压力或环境因素在该群体中对下颌前突的形成具有重要影响。此外，A等位基因的频率在病例组中为38.66%，而在对照组中为31.42%，这一差异进一步支持了AA基因型与下颌前突之间的潜在联系。

### 生物信息学分析

为了进一步理解rs1383180变异对EVC蛋白功能的影响，研究团队使用了多种生物信息学工具进行分析。这些工具包括MUpro、iStable、DynaMut2、INPS-MD、SWISS-MODEL、ConSurf、PhD-SNPg和Cscape。分析结果表明，G > A的突变可能削弱EVC蛋白的结构稳定性和功能。MUpro和iStable预测该突变会导致蛋白质稳定性下降，而DynaMut2和INPS-MD则进一步证实了这一趋势，预测了该突变对蛋白质结构的破坏性影响。

SWISS-MODEL的结构分析显示，野生型EVC蛋白的残基分布具有较强的立体化学稳定性，大部分残基位于允许区域。然而，rs1383180突变后，部分残基进入禁用区域，表明该突变可能对蛋白质的三维结构产生一定的干扰。ConSurf的进化保守性分析显示，该位点的平均残基保守性为5，表明其在进化过程中受到一定程度的约束，但并非高度保守。PhD-SNPg和Cscape的分析结果则更加强烈地支持了rs1383180可能具有致病性或促癌性，进一步突显了该SNP在下颌发育中的潜在重要性。

这些生物信息学分析的结果一致表明，rs1383180的G > A突变可能通过影响EVC蛋白的结构和功能，进而干扰Hedgehog信号通路的正常运作。Hedgehog信号通路在骨骼发育、软骨形成和组织分化中起着关键作用，因此，任何对该通路的干扰都可能对下颌的形态产生深远影响。

### 研究结果与讨论

研究结果表明，rs1383180的AA基因型与下颌前突存在显著的统计学关联（p = 0.036），而GA基因型和A等位基因的频率虽然有所上升，但未达到显著水平。这提示AA基因型可能是下颌前突的主要风险因素，而GA基因型和A等位基因可能在某些情况下起到辅助作用。值得注意的是，该SNP与下颌后缩无显著关联，表明其可能主要影响下颌的过度生长，而非生长不足。

此外，研究团队还对样本进行了头影测量分析，结果进一步验证了上述基因型与下颌形态之间的关联。下颌前突患者的SNB角显著高于正常对照组，而Wits值则显著低于正常范围，符合下颌前突的典型特征。相比之下，下颌后缩患者的SNB角显著低于正常范围，Wits值则显著升高，符合其分类标准。这些结果与基因型分析相辅相成，进一步支持了rs1383180在下颌发育中的潜在作用。

然而，研究也存在一定的局限性。首先，样本量相对较小，可能无法充分代表遗传复杂性。其次，研究仅关注单一SNP，而实际的骨骼发育可能受到多个基因变异的共同影响。因此，未来的研究应考虑扩大样本规模，并探索其他可能的EVC基因变异，以更全面地理解其在下颌发育中的作用。此外，研究团队还指出，由于样本中包含了轻度至重度的下颌前突病例，未来的研究可以聚焦于极端表型，以更清晰地揭示EVC基因的功能。

### 结论与展望

综上所述，本研究首次报道了rs1383180的AA基因型与下颌前突之间的显著关联。这一发现为理解下颌前突的遗传基础提供了新的线索，并表明该SNP可能通过干扰Hedgehog信号通路，影响下颌的过度生长。此外，研究还指出，该SNP可能对下颌后缩无明显影响，说明其作用具有一定的特异性。

未来的研究可以进一步探讨rs1383180在不同人群中的普遍性，并结合其他基因变异进行多基因分析，以更全面地揭示下颌发育的遗传机制。此外，研究团队建议未来的工作应关注基因-环境相互作用，探索外部因素如何与遗传变异共同影响下颌形态。这些研究不仅有助于加深对骨骼发育的理解，还可能为个性化正畸治疗和遗传咨询提供新的方向。