低分子肝素-三乙醇胺乳膏的研制与特性分析：皮肤渗透性及抗血栓效果

《Journal of Pharmaceutical Sciences》：Development and characterization of low molecular weight heparin-triethanolamine cream: Skin permeability and antithrombotic efficacy

LMWH-TEA制备及透皮抗血栓效果研究。通过替换LMWH金属盐复合物为三乙醇胺复合物，显著提高其脂溶性，增强皮肤渗透性，体外实验显示LMWH-TEA cream比LMWH-Na cream渗透性高48小时。体内抗血栓实验表明0.3% LMWH-TEA cream（0.5g）较常规组及LMWH-Na组血栓抑制率提升32.6%。该新型透皮制剂为临床应用提供新思路。

　　

长森雅良 | 上宫清太郎

日本西宫市小塚田町11-68，武库川女子大学药学部，663-8179

摘要

肝素的凝血因子抑制活性因其分子大小而异。与未分馏肝素相比，低分子肝素（LMWH）的副作用（如出血）较少，因此受到了关注。为了开发具有高皮肤渗透性的LMWH制剂，通过将LMWH的金属离子复合物替换为三乙醇胺（TEA）复合物，制备了一种脂溶性更好的LMWH-TEA乳膏。采用高效液相色谱法（HPLC）结合荧光检测建立了LMWH-TEA的定量方法。结果表明，LMWH-TEA的分配系数随pH值降低而增加，表明其在酸性条件下的亲脂性增强。在皮肤渗透实验中，LMWH-TEA的皮肤渗透性在48小时内均高于LMWH-Na。在卡拉胶诱导的大鼠尾部血栓形成模型中，使用0.5% LMWH-TEA乳膏处理的组别表现出比未处理对照组和使用0.3% LMWH-Na乳膏处理的组别更强的抗血栓效果。LMWH-TEA可作为新型的LMWH透皮制剂，在临床实践中得到广泛应用。

引言

肝素是一种高度硫酸化的多糖，属于糖胺聚糖类，带有强负电荷，通常以钠、钾、钙等金属盐的形式存在。1, 2 肝素作为抗凝剂，通过激活抗凝血酶III（ATIII）来抑制凝血系统。1, 2 它用于治疗和预防血栓栓塞症、弥散性血管内凝血综合征（DIC）和深静脉血栓形成（DVT），以及透析和体外循环过程中的抗凝。1, 3, 4 ATIII通过与凝血酶、Xa因子等丝氨酸蛋白酶的活性位点结合来抑制它们。肝素与ATIII形成复合物，改变其结构并增强其抑制作用。凝血酶对肝素-ATIII复合物的亲和力高于对Xa因子的亲和力。5, 6

自1976年Andersson等人发现低分子肝素（LMWH）以来，1, 7 肝素的凝血因子抑制活性因分子量不同而产生的差异引起了关注。8, 9 LMWH是通过化学或酶法水解市售未分馏肝素（UH）得到的硫酸化多糖，带有负电荷，分子量范围为2至10 kDa（平均分子量：4.5 kDa）。10, 11 由于其糖链较短，LMWH能够与抗凝血酶III（ATIII）结合，但无法同时与凝血酶结合。10 因此，LMWH不会抑制凝血酶活性，从而降低了出血风险。临床上通常通过静脉或皮下注射给药。12 然而，即使使用LMWH，全身给药仍难以避免副作用。与全身给药相比，局部给药可以减少副作用。13, 14 因此，人们开发了LMWH的透皮制剂，用于治疗循环障碍引起的疼痛、炎症性疾病和冻伤；促进血液循环；以及保湿。15 但是，LMWH的金属盐在制剂中容易解离，使得阴离子型LMWH难以渗透皮肤。为克服这一难题，人们采用了超声孔化技术（通过改善细胞膜通透性引入LMWH）、LMWH微针制剂以及含有LMWH的脂质囊泡（如脂质体）等方法，这些方法显示出比局部给药更好的吸收效果。15, 16, 17 还有研究表明，含有生物相容性膜软化剂的脂质体双层结构（Flexosomes）能够将LMWH深入皮肤输送。18 尽管这些制剂很有前景且有望进一步改进，但其配方复杂性的增加使得安全性评估和临床试验更加耗时，生产成本也更高。

本研究旨在通过将LMWH的金属离子复合物替换为三乙醇胺（TEA）复合物来开发具有更高皮肤渗透性的LMWH制剂。LMWH-TEA复合物较为稳定，且由于其脂溶性提高，有望改善皮肤渗透性。本文报道了LMWH-TEA在乳膏制剂中的有效性、在尤卡坦微猪皮肤上的皮肤渗透性以及在卡拉胶诱导的大鼠尾部血栓模型中的药理作用。

材料

LMWH-TEA按照专利JP2005-220347A中描述的方法合成，并由Gene Techno Science有限公司（日本札幌）提供。2-氨基吡啶（2-AP）（Wako，日本大阪）、氰硼氢化钠（Sigma-Aldrich，美国圣路易斯）、单硬脂酸甘油酯（Nikko Chemicals，日本东京）、癸酸十酯（Cognis，日本东京）、十六烷基醇（Kokyu Alcohol Kogyo，日本千叶）、聚山梨醇1000（Nikko Chemicals，日本东京）、乙醇（Kokyu Alcohol Kogyo，日本千叶）等试剂也用于实验。

LMWH-TEA及其分配系数的测定

包括肝素在内的多糖采用HPLC-FL进行定量，该方法具有高灵敏度。还原胺化反应可促进2-AP与单糖和寡糖的荧光标记；类似的方法分别用于从LMWH-TEA和LMWH-Na中制备2-AP标记的样品。图1显示了2-AP标记的LMWH的典型色谱图。如图S1所示，2-AP标记的LMWH-TEA和LMWH-Na均表现出良好的线性，校准曲线亦符合预期。

讨论

与未分馏肝素（UH）相比，LMWH由于安全性更好、副作用更低，成为治疗血栓症和炎症性疾病的有前景的药物。LMWH的局部给药因其较低的不良反应而受到关注，因此人们致力于开发提高其透皮渗透性的方法。与UH类似，LMWH含有大量负电荷的硫酸基团，这有助于其发挥作用。

结论

本研究通过用TEA替换LMWH中的金属盐，在弱酸性条件下提高了其亲脂性，从而制备了具有更好皮肤渗透性的乳膏制剂。在体外实验中，使用Franz扩散细胞测试发现LMWH-TEA的皮肤渗透性优于LMWH-Na。

资助

本研究得到了武库川女子大学和长崎国际大学的支持。

利益冲突声明

作者声明没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢长崎国际大学的荒川雅之博士提供的指导与启发。