基于绿色化学的可持续提取方法：利用深共晶溶剂从姜黄（Curcuma longa L.）中高效提取姜黄素类化合物

《LWT》：Green chemistry-based sustainable extraction of curcuminoids from turmeric ( Curcuma longa L.) using deep eutectic solvents for efficient extraction

姜黄素oids的绿色提取技术：基于自然深共熔溶剂（NADES）的优化与回收研究

　　本研究提出了一种可持续的方法，用于从姜黄（*Curcuma longa*）中提取姜黄素类化合物，使用的是天然深共沸溶剂（NADES）。通过合成64种不同的NADES组合，结合胆碱氯化物、有机酸和多元醇，评估了它们的物理化学性质。研究发现，由胆碱氯化物、草酸和丁烯-1,4-二醇组成的三元NADES（摩尔比为1:1:2）能够获得最高的姜黄素类化合物总提取量。进一步使用Box-Behnken设计和响应面法对提取条件进行了优化，确定了最佳的提取参数：温度为46.8–49.3 °C，时间为16分钟，丁烯-1,4-二醇的摩尔比为2.7。水稀释法（50倍）能够回收82.7–90.9%的姜黄素类化合物，其回收率优于固相萃取法。此外，使用NADES提取的姜黄素类化合物的稳定性与传统有机溶剂相当，这表明该方法在环境友好性和效率方面具有显著优势，为功能性食品和制药领域的应用提供了新的可能性。

姜黄作为一种传统药材，已被广泛用于增强食物的风味和颜色。它含有约1–6%的干重作为复杂的二芳基戊烷类和二芳基庚烷类化合物的混合物，其中主要包括差黄素甲烷、去甲基姜黄素（DMC）和双去甲基姜黄素（BMC），这些成分统称为姜黄素类化合物。姜黄素是一种疏水性的多酚类化合物，是姜黄素类化合物的主要黄色色素。由于其在水中的溶解度较低（估计为1–10 μg/mL），大多数关于姜黄素类化合物生物活性的研究使用有机溶剂如甲醇、乙醇和丙酮提取的样品进行。然而，这些溶剂存在残留溶剂、生物毒性及环境污染等问题，因此需要开发更先进的提取和纯化技术。

提取是分离天然来源中生物活性化合物的关键步骤。NADES作为一种环保溶剂，能够提高功能性化合物的提取和储存效率。NADES由氢键供体（HBDs）和受体（HBAs）组成，通过深共沸效应形成具有广泛极性的提取溶剂，同时降低其熔点。特别是以胆碱氯化物为基础的HBAs和以有机酸为基础的HBDs，能够有效提取非极性化合物，其提取效率高于传统有机溶剂。NADES还能在提取和储存过程中增强化合物的稳定性。尽管NADES具有诸多优势，但在实际应用中仍面临一些挑战，例如化学组合的多样性、高粘度以及有限的质量传递。三元溶剂的使用可以克服这些缺点，通过增强结构稳定性和降低粘度来提高提取效率。

本研究的目标是开发并优化一种环保的姜黄素类化合物提取和回收方法，使用由胆碱氯化物、有机酸和多元醇组成的NADES。通过比较不同NADES的物理化学性质（粘度、pH值和极性）和提取效率，研究进一步验证了姜黄素类化合物与NADES之间的分子相互作用。本研究提供了一种高性能的绿色溶剂模型，用于姜黄素类化合物的提取。

研究中使用的化学品和材料包括从Thermo Fisher Scientific公司购买的姜黄素类化合物（纯度>98%，包含BMC、DMC和CUR的混合物），以及从Sigma-Aldrich公司购买的胆碱氯化物、草酸、苹果酸、柠檬酸、酒石酸、丁烯-1,3-二醇、丁烯-1,4-二醇、甘油和乙二醇。此外，还从Tokyo Chemical Industry公司购买了尼罗红（Nile Red），用于测量NADES的极性。

NADES的制备方法是通过加热和搅拌，按照之前描述的方法进行。胆碱氯化物作为HBAs，与不同的HBDs（如柠檬酸、苹果酸、草酸和酒石酸，丁烯-1,3-二醇、丁烯-1,4-二醇、甘油和乙二醇）结合。每种混合物在80°C下持续搅拌2小时，直至形成透明液体。详细的配方和摩尔比总结在表格S1中。所有制备的NADES在室温下避光保存，以备后续使用。

姜黄素类化合物的提取过程使用NADES进行。研究中使用的姜黄样品购自Chungsu Medicinal Herbs公司。将姜黄块茎研磨2分钟，转速为10,000 rpm，使用Tube mill控制仪。随后，将研磨后的材料进行冷冻干燥，持续72小时。干燥后的姜黄通过60目标准筛分，保存在室温下进行分析。姜黄素的提取方法基于先前的报告进行。将50毫克姜黄粉末与15毫升NADES混合在50毫升聚丙烯管中，通过涡旋1分钟使其均匀，然后在40°C下超声处理15分钟。提取液通过离心（1,997 × *g*，20分钟）收集，上清液稀释后通过0.45微米聚偏二氟乙烯（PVDF）注射器过滤器过滤。

为了分析姜黄素类化合物，研究使用了液相色谱（LC）系统，包括Nexera XR和光二极管阵列检测器。色谱分离在Zorbax Eclipse C18柱上进行，采用梯度洗脱程序，溶剂A为含0.1%甲酸的水，溶剂B为含0.1%甲酸的乙腈。洗脱程序为：0–9分钟，45% A；9–10分钟，45% A变为10% A；10–12分钟保持10% A；12–13分钟恢复为45% A；13–15分钟保持45% A。流速、柱温及进样体积分别为0.8 mL/min、40°C和5 μL。三种姜黄素类化合物在420 nm下进行监测。

此外，研究还使用了LC-Orbitrap系统（Q-Exactive）进行姜黄素类化合物的定性分析。色谱分离在CORTECS T3 C18柱上进行，采用0.1%（v/v）甲酸水（A）和0.1%（v/v）甲酸乙腈（B）的梯度洗脱方案。洗脱程序为：0–0.1分钟，3%–3% B；0.1–15分钟，3%–15% B；15–50分钟，15%–100% B；50–55分钟保持100% B；55–60分钟恢复为3% B。流速、柱温及进样体积分别为250 μL/min、45°C和2 μL。质谱分析在加热电喷雾电离模式下进行，离子喷雾电压为3,000 V，源温度为320°C，鞘气流速为50 arb，辅助气流速为10 arb，扫气流速为1 arb，质谱扫描范围为*m/z* 100–1,500。

为了评估NADES的物理化学性质，研究测量了其pH值、粘度和极性。pH值使用校准的pH计（PB-10，Sartorius公司）测定。粘度在25°C下使用Brookfield旋转粘度计（DV-1+，AMETEK公司）测定，配备常规测量筒。极性使用尼罗红（Nile Red）进行测定，依据先前的报告方法。尼罗红制备为5 mM的乙醇溶液（96%），随后与980 μL的NADES和20 μL的尼罗红溶液混合。尼罗红混合物的吸收峰（λmax）在400–700 nm范围内测量，并使用方程计算。

研究还使用COSMOthermX软件（版本18，COSMOlogic GmbH & Co. KG公司）和DFT计算的分子模型预测了sigma表面和sigma曲线数据。在COSMO-RS框架下，各组分被设计为固定摩尔比，胆碱氯化物作为离子对以优化计算。此外，使用傅里叶变换红外光谱（FT-IR）分析了由胆碱氯化物、草酸和丁烯-1,4-二醇组成的OB42的化学结构和分子间键，波数范围为4,000–650 cm?1。

在优化提取条件方面，研究应用了三水平三因素的Box-Behnken设计（BBD）和响应面法（RSM）。提取参数基于先前的报告进行设定。三个关键的独立参数被选为优化对象：提取温度（A；20、40和60°C）、提取时间（B；5、15和25分钟）以及胆碱氯化物、草酸和丁烯-1,4-二醇的摩尔比（C；1:1:0、1:1:2和1:1:4）。三种姜黄素类化合物被用作响应变量，以确定最佳条件。实验设计使用Design-Expert软件（23.1.8，Stat-Ease Inc.公司）进行，共进行了15次实验，包括三个重复的中心点以确保结果的可靠性。每次实验重复进行，并使用姜黄素类化合物的含量作为响应变量。实验结果被拟合为一个二次多项式模型，模型的适配性和统计显著性通过方差分析（ANOVA）进行评估。此外，ANOVA还用于评估交互作用的影响，统计显著性基于p值确定。

在评估NADES提取后的姜黄素类化合物回收方面，研究使用了反溶剂方法，根据先前的报告进行。简要来说，不同比例（v/v）的水（1:25、1:50、1:75和1:100）被添加到提取后的NADES中，并在室温下搅拌1小时。混合物随后在4°C下孵育24小时。沉淀物通过离心（4°C和10,000 rpm，20分钟）收集，上清液使用冷冻干燥机（FD 8518）干燥。反溶剂方法与固相萃取（SPE）方法进行了比较，使用C18柱进行提取。提取后的NADES（200 μL）被加载到C18柱上，并通过50 mL水进行洗脱。随后，添加50 mL甲醇以洗脱姜黄素类化合物。两种方法获得的姜黄素类化合物提取物均通过LC系统进行定量分析。

在评估NADES中姜黄素类化合物的稳定性方面，研究比较了水、甲醇、乙醇和NADES（OB42）提取后的样品。所有提取物在黑暗中4°C下保存9天，每种提取物中三种姜黄素类化合物的浓度均通过LC系统进行定量分析。结果显示，使用NADES提取的姜黄素类化合物在稳定性方面表现良好，其稳定性与传统有机溶剂相当。

研究中的所有实验均进行三次重复，结果以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism 8.4.3（GraphPad Software Inc.公司）生成图表，使用Design-Expert 23.1.8（Stat-Ease Inc.公司）获得响应面图。统计分析使用JMP? 15（SAS Institute Inc.公司）进行，通过ANOVA和Tukey’s后验检验（p < 0.05）来确定均值间的显著性差异。

研究结果显示，使用不同NADES提取的姜黄素类化合物含量存在显著差异。例如，使用甲醇和乙醇提取的总姜黄素类化合物含量分别为9.47和7.59 mg CE/g，而使用水提取的含量仅为0.12 mg CE/g，仅为甲醇提取的约63分之一。这表明，姜黄素类化合物作为有机化合物，其极性较低，因此更倾向于使用低极性有机溶剂如己烷或丙酮进行提取。然而，研究中使用的NADES（OB42）表现出更高的提取效率，其总姜黄素类化合物含量达到12.74 mg CE/g，这表明NADES在提取效率方面具有显著优势。

在筛选NADES方面，研究发现，由有机酸和胆碱氯化物组成的二元NADES（如CO、CM、CC和CT）的平均提取效率仅为0.51 mg CE/g。相比之下，含有丁烯-1,4-二醇的三元NADES（如OB42）的平均提取效率达到2.73 mg CE/g，是二元NADES的两倍。这表明，丁烯-1,4-二醇的添加能够有效降低NADES的粘度，同时提高提取效率。然而，过量的水含量会对姜黄素类化合物的提取产生不利影响，例如在由胆碱氯化物、有机酸和水组成的1:1:3摩尔比的NADES中，姜黄素类化合物的提取效率显著降低。因此，研究中选择的三元NADES（OB42）在粘度和极性方面均表现出良好的性能，同时其提取效率显著高于含有水的NADES。

在NADES的物理化学性质方面，研究发现，随着第三组分（多元醇）的比例增加，粘度降低。然而，粘度与总姜黄素类化合物提取效率之间没有显著相关性（R2 = 0.15）。因此，只有1:1:2摩尔比的NADES被选为代表性分析其物理化学性质。研究还发现，含有有机酸的NADES的pH值均低于2.0，这有助于姜黄素类化合物的稳定性。在酸性环境中，姜黄素类化合物的酚羟基被质子化，从而稳定其共轭二烯结构。相比之下，在中性和碱性条件下，姜黄素类化合物极易降解，其降解主要由氧化反应引起。

在sigma曲线分析方面，研究发现，含有丁烯-1,4-二醇的NADES（OB42）在非极性区域表现出更高的极性，这表明其能够有效促进姜黄素类化合物的提取。此外，研究通过FT-IR分析了OB42的化学结构，确认其组分的特征官能团在形成NADES后仍然存在。例如，OB42的FT-IR光谱显示了O–H伸缩振动峰（3227.4 cm?1）、C–H伸缩信号（2978.5 cm?1）、C=O伸缩带（1740.4 cm?1）以及C–O伸缩峰（1183.1 cm?1和1055.8 cm?1）。这些结果进一步验证了OB42在姜黄素类化合物提取中的有效性。

在优化提取条件方面，研究使用BBD方法确定了最佳的提取参数。最佳提取条件为温度46.8–49.3 °C、时间为16分钟、丁烯-1,4-二醇的摩尔比为2.7。实验结果与理论模型的相对误差在3%以内，表明优化后的提取条件具有较高的准确性和可靠性。此外，研究通过响应面分析进一步验证了这些参数的适用性，展示了提取效率与各因素之间的相互作用。

在姜黄素类化合物的回收方面，研究发现，水稀释法（50倍）能够回收82.7–90.9%的姜黄素类化合物，优于固相萃取法（SPE）。尽管SPE方法在使用有机溶剂时具有较高的回收率，但其环境可持续性较差。相比之下，水稀释法是一种环保的回收方法，能够有效地从NADES中提取目标化合物。此外，研究发现，NADES的低蒸气压和高粘度使得目标化合物的回收变得复杂，因此需要优化回收条件。

在姜黄素类化合物的稳定性方面，研究发现，使用NADES（OB42）提取的姜黄素类化合物在储存9天后仍保持较高的稳定性（平均为91.8%），优于水、甲醇和乙醇提取的样品（平均分别为48.2%、89%和89%）。这表明，NADES在提取过程中能够提供稳定的环境，从而减少姜黄素类化合物的降解。此外，研究还发现，姜黄素类化合物的稳定性受pH值和温度的影响显著。在酸性条件下，姜黄素类化合物较为稳定，而在中性和碱性条件下则极易降解。因此，NADES的酸性环境有助于保持姜黄素类化合物的稳定性。

综上所述，本研究提出了一种可持续且高效的NADES提取姜黄素类化合物的方法。通过优化提取条件，研究确定了最佳的提取参数，提高了提取效率。此外，研究还验证了NADES在回收和稳定性方面的优势，为功能性食品和制药行业提供了新的提取和纯化策略。未来的研究可以进一步探索该方法在工业规模应用中的可行性和经济性，以及其在不同原料和提取条件下的适应性。