利用液氮作为无抗生素替代品，快速制备释放一氧化氮的羟基磷灰石微球

《Nitric Oxide》：Rapid Fabrication of Nitric Oxide Releasing Hydroxyapatite Microspheres Using Liquid Nitrogen as an Antibiotic-Free Alternative

硝基氧化合物负载羟基磷灰石微球通过缓释NO实现高效抗菌，不引发耐药性。摘要：采用低温冷冻法制备SNAP-HA微球，负载率1.05%-16.42%，通过化学发光法证实最长NO缓释达66小时，FT-IR证实SNAP保留，SEM显示表面抗菌活性达100%。

　　细菌感染是全球公共卫生面临的重要挑战之一。尽管抗生素是目前治疗感染的主要手段，但由于其广泛使用导致的耐药性问题，促使科研人员迫切需要开发新的、安全且有效的抗菌策略。在这一背景下，研究人员成功制备了一种能够可控释放一氧化氮（NO）的抗菌SNAP-HA微球。该微球通过将S-硝基化-N-乙酰半胱氨酸（SNAP）负载于羟基磷灰石（HA）中实现，SNAP的负载率在1.05%至16.42%之间。实验通过化学发光法测定了NO的释放情况，结果显示，SNAP-HA微球的NO释放时间最长可达约66小时。此外，通过氢核磁共振（1H NMR）技术对SNAP的分解产物进行了表征。在结构、热性能和形态方面，SNAP-HA微球也得到了全面分析。研究发现，SNAP在HA微球中以非晶态形式存在。在抗菌实验中，SNAP-HA微球能够达到100%的最优抗菌效果，对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）均表现出显著的杀菌能力。这种微球通过释放NO气体发挥抗菌作用，不会刺激细菌产生耐药性，因此被视为一种潜在的新型抗菌产品。

羟基磷灰石（HA）因其卓越的生物相容性和与人体骨骼成分的相似性，广泛应用于生物医学领域，特别是在骨修复、组织工程和药物输送方面。HA常用于修复骨折和治疗骨缺陷，作为植入物和人工关节中的重要骨替代材料。在骨组织工程中，HA作为支架材料，能够促进骨细胞的增殖和分化，从而有助于骨组织的再生。此外，HA在牙科领域也有广泛应用，尤其是在牙科修复和植入方面。纳米级的HA由于其更高的生物活性和良好的降解特性，在纳米药物输送和抗菌应用中展现出广阔前景。HA还是一种理想的药物输送载体，能够封装抗生素、抗癌药物等治疗药物，并精确控制其释放速率，实现对特定部位的靶向输送。然而，尽管HA在生物医学应用中前景广阔，特别是在骨组织修复、药物输送和感染控制方面，其本身缺乏抗菌性能，限制了其在生物医用材料中的更广泛应用。因此，如何在保持HA生物相容性的同时增强其抗菌能力，成为未来研究中的重要课题。

由于HA本身不具备抗菌特性，许多研究人员致力于对其进行抗菌改性，希望提高其抗感染能力，从而更好地服务于临床。目前，向HA中添加金属离子是主要的改性方法之一。尽管存在多种具有抗菌作用的金属离子，但银离子（Ag?）被认为是其中最关键的一种。Pinchuk等人成功利用微波辅助合成的水热技术合成了银掺杂的羟基磷灰石（HAP: 1 mol% Ag?），其样品对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均表现出显著的抗菌活性。Deng等人则通过沉淀和水热方法合成了银负载的羟基磷灰石纳米棒（Ag-HA），其产品与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌共培养后，显示出良好的杀菌效果。Li等人制备了同时掺杂铁和硅的HA纳米棒，并将其与抗菌肽HHC-36化学键合。虽然HA纳米棒本身无法直接杀死细菌，但在HHC-36的辅助下，纳米棒通过物理穿刺的方式有效杀灭了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。

一氧化氮（NO）作为一种重要的生物活性分子，具有多种显著的生物功能，包括抗菌、抗炎、促进血管生成和调节免疫反应。因此，设计和开发能够释放NO的材料，以增强抗菌性能并保持良好的生物相容性，已成为生物医学领域的重要研究方向。这类材料能够通过持续释放NO有效抑制细菌的生长，促进伤口愈合，并减少炎症反应，广泛应用于抗菌涂层、敷料、骨修复和植入材料中。在抗菌应用方面，NO通过其强氧化性以及对细菌细胞膜的破坏作用，能够有效抑制细菌的生长和繁殖，展现出巨大的潜力，特别是在治疗由耐药菌引起的感染方面。此外，NO还能调节免疫反应，促进组织修复，并加速伤口愈合。同时，NO释放材料的生物相容性对于其成功应用至关重要。通过控制NO的释放速率和剂量，可以在实现最佳生物效应的同时避免毒性副作用。因此，开发NO释放材料不仅有助于提升抗菌性能，还为有效应对常见感染性疾病提供了新的解决方案，进而改善患者的治疗效果。

在本研究中，研究人员通过将SNAP与HA结合在粘合剂（3%高分子量聚乙烯醇、3%羧甲基纤维素和5%聚丙烯酸铵分散剂）中，并使用液氮快速冷冻，成功制备了SNAP-HA微球。SNAP的负载率通过紫外-可见光谱仪测定，具体计算基于SNAP标准曲线（图S1）中在339 nm波长下的紫外-可见吸收数据。实验还通过红外光谱（IR）验证了HA微球中的功能基团，并进一步研究了SNAP-HA微球的形态和元素分布。NO的释放情况通过化学发光法进行测量，而1H NMR技术则用于表征SNAP的分解产物。此外，研究团队还测试了SNAP-HA微球对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性，并通过扫描电子显微镜（SEM）观察了细菌表面在抗菌作用前后的变化。研究人员认为，这些具有抗菌特性的NO释放SNAP-HA微球有望成为抗生素的替代品。

在材料制备过程中，研究人员采用了多种分析手段以确保SNAP-HA微球的性能和结构符合预期。首先，通过紫外-可见光谱仪测定SNAP的负载率，这一方法基于SNAP在特定波长下的吸收特性，并结合标准曲线进行定量分析。研究发现，SNAP的负载率在不同实验条件下呈现出显著的变化，范围从1.05%至16.42%。这种差异可能与SNAP在HA中的分散方式、粘合剂的种类以及冷冻过程中的条件变化有关。其次，通过红外光谱分析，研究人员确认了HA微球中的功能基团是否发生了改变，这有助于理解SNAP与HA之间的相互作用。同时，热重分析（TGA）被用于研究SNAP-HA微球的热性能，这为评估其在不同温度条件下的稳定性提供了重要依据。X射线衍射（XRD）分析进一步确认了SNAP在HA微球中的非晶态结构，表明其在微球内部以一种无定形态存在，这可能有助于提高其在释放过程中的均匀性和可控性。

在抗菌实验中，研究人员通过与大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的共培养实验，评估了SNAP-HA微球的抗菌能力。实验结果显示，SNAP-HA微球能够达到100%的最优抗菌效果，表明其在抑制细菌生长方面具有显著的优势。这种抗菌能力的实现主要依赖于NO的释放，而NO作为一种强氧化性分子，能够破坏细菌细胞膜的完整性，进而抑制其生长和繁殖。此外，研究还通过扫描电子显微镜观察了细菌表面在接触SNAP-HA微球前后的变化，结果显示，细菌表面在抗菌作用后发生了显著的结构变化，这进一步支持了NO在抗菌过程中发挥关键作用的假设。同时，研究人员还探讨了SNAP-HA微球在不同条件下的抗菌性能，包括NO释放速率、微球的物理结构以及细菌的种类等因素，这些研究为优化抗菌效果提供了重要的参考。

本研究的创新之处在于成功将SNAP与HA结合，形成一种具有可控释放NO能力的抗菌微球。与传统的抗菌材料相比，这种微球不仅能够有效抑制细菌的生长，而且由于NO的释放过程是缓慢且可控的，因此在使用过程中能够减少对细菌的刺激，从而降低耐药性的发生概率。此外，SNAP-HA微球的生物相容性得到了充分验证，表明其在体内环境中的应用具有可行性。研究还发现，这种微球在形态和结构上保持了HA原有的特性，同时通过SNAP的引入赋予其抗菌功能。这一发现为开发新型抗菌材料提供了新的思路，同时也为解决抗生素耐药性问题提供了可能的解决方案。

在实际应用中，SNAP-HA微球可能被用于多种场景，包括抗菌涂层、伤口敷料、骨修复材料以及植入物等。由于其能够缓慢释放NO，这种微球在长期抗菌应用中表现出良好的稳定性，能够持续发挥抗菌作用，从而减少感染的发生率。此外，SNAP-HA微球的抗菌能力不仅适用于常见的病原菌，如大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，还可能对其他类型的细菌，包括耐药菌，表现出良好的抑制效果。这使得SNAP-HA微球在应对多重耐药菌感染方面具有重要潜力。同时，由于NO在体内具有良好的生物相容性，SNAP-HA微球在临床应用中可能不会引起明显的副作用，这进一步提高了其作为抗菌替代品的安全性。

研究团队在本工作中还考虑了材料的制备条件对性能的影响。通过调整粘合剂的种类和比例，以及控制冷冻过程中的温度和时间，研究人员优化了SNAP-HA微球的性能。这些优化措施不仅提高了微球的抗菌效果，还增强了其在不同环境下的稳定性。此外，研究还探讨了不同负载率对微球抗菌能力的影响，结果显示，较高的SNAP负载率能够提高NO的释放量，从而增强抗菌效果。然而，过高的负载率可能导致微球结构的破坏，影响其释放性能和生物相容性。因此，研究人员在实验中选择了合适的负载率范围，以确保微球在保持结构完整性的同时能够发挥最佳的抗菌效果。

本研究的实验设计和方法为未来抗菌材料的开发提供了重要的参考。通过将SNAP与HA结合，研究人员成功制备了一种新型抗菌材料，这种材料不仅具备良好的抗菌性能，还具有可控的NO释放能力，能够减少耐药性的发生。此外，实验中采用的多种分析手段，如紫外-可见光谱、红外光谱、热重分析、X射线衍射和扫描电子显微镜等，为全面评估材料的性能提供了科学依据。这些分析手段的应用不仅有助于理解材料的结构和功能，还为优化其性能提供了重要指导。

从长远来看，SNAP-HA微球的开发具有重要的应用前景。随着抗生素耐药性问题的日益严重，寻找替代性的抗菌策略成为医学界的重要课题。SNAP-HA微球作为一种新型抗菌材料，能够有效解决这一问题，同时具备良好的生物相容性和可控性，使其在临床应用中具有更高的可行性。此外，这种微球的抗菌能力不仅适用于常见的细菌感染，还可能对更复杂的感染情况，如多重耐药菌感染，提供有效的解决方案。因此，SNAP-HA微球的开发不仅在抗菌领域具有重要意义，还可能在其他生物医学应用中发挥重要作用。

在材料的制备过程中，研究人员还关注了其在不同条件下的性能表现。例如，微球在不同的温度、湿度和pH值环境下是否能够保持稳定的NO释放能力，以及其在体内环境中的降解特性是否符合要求。这些研究为SNAP-HA微球的实际应用提供了重要的参考，同时也为优化其性能提供了新的方向。此外，研究人员还探讨了微球在不同应用场景下的适用性，包括其在抗菌涂层、伤口敷料和骨修复材料中的应用。这些研究不仅拓展了SNAP-HA微球的应用范围，还为未来相关材料的开发提供了重要的启示。

总体而言，本研究通过将SNAP与HA结合，成功制备了一种具有可控释放NO能力的抗菌微球，这种微球在抗菌性能和生物相容性方面表现出显著优势。研究结果表明，SNAP-HA微球不仅能够有效抑制细菌的生长，而且由于NO的释放过程是缓慢且可控的，因此在使用过程中能够减少对细菌的刺激，从而降低耐药性的发生概率。此外，这种微球的抗菌能力不仅适用于常见的病原菌，还可能对更复杂的感染情况提供有效的解决方案。因此，SNAP-HA微球的开发为解决抗生素耐药性问题和提高抗菌治疗效果提供了新的思路和方法。