一种多重PCR方法，用于快速检测临床和环境来源的肠球菌中的万古霉素和利奈唑胺耐药基因：一种“同一健康”（one health）诊断策略

《One Health》：A multiplex PCR for rapid detection of vancomycin and linezolid resistance genes in clinical and environmental enterococci: A one health diagnostic approach

本研究开发了基于多重PCR检测耐甲氧西林肠球菌（VRE）和线唑酮耐药基因（LZRE）的分子诊断方法，评估其在医院临床样本和养鸡场环境样本中的性能。结果显示，该方法对VRE的敏感度为71.8%，特异性100%；对LZRE的敏感度88.9%，特异性100%，准确性达97.1%。证实多重PCR技术能有效整合人类、动物和环境耐药监测，支持One Health框架下的快速诊断和耐药防控。

　　抗生素耐药性（AMR）已成为全球公共卫生领域的重要挑战之一，特别是在肠球菌属中，耐万古霉素（VRE）和耐利奈唑胺（LZRE）菌株的出现对临床治疗和疾病控制构成了巨大威胁。肠球菌，尤其是粪肠球菌（*E. faecalis*）和屎肠球菌（*E. faecium*），因其在血液感染、尿路感染以及腹腔脓毒症中的频繁出现而受到关注。这类革兰氏阳性微生物不仅在医院环境中是重要的医院感染源，而且在免疫功能低下的患者中更容易导致病情复杂化。随着抗生素的滥用和过度使用，VRE和LZRE在人类临床样本和动物环境中的出现频率不断增加，尤其是在食品生产动物中，这使得它们成为跨生态系统传播的重要媒介。

在应对这一问题方面，传统的方法如表型和培养基的药敏测试虽然在实践中被广泛应用，但它们存在时间长、操作复杂以及可能遗漏某些耐药基因的缺点。特别是在检测耐药基因时，表型测试可能因菌株的表型异质性或生长延迟而产生误导。因此，分子诊断技术如聚合酶链式反应（PCR）成为一种更高效和精准的替代方法。PCR技术能够在数小时内直接从临床或环境样本中检测出耐药基因，从而实现快速诊断和及时干预。特别是在多药耐药菌株日益增多的背景下，多色PCR技术因其能够同时检测多种耐药基因而显示出显著的优势。

本研究旨在评估一种多色PCR技术在检测肠球菌中耐万古霉素和利奈唑胺耐药基因方面的性能，并在马来西亚吉兰丹的医院和家禽养殖场中进行回顾性监测。该研究结合了临床微生物学和环境监测，以推动符合“一个健康”理念的整合性耐药监测。多色PCR技术能够同时检测包括*vanA*、*vanB*、*vanC*、*vanD*、*optrA*、*poxtA*和*cfr*在内的多种耐药基因，这为耐药性监测提供了全面的视角。

在回顾性研究阶段，使用了11种参考菌株进行敏感性和特异性评估。所有目标菌株均被成功检测，而26种非目标菌株则未被检测到，这表明该技术具有良好的特异性。在分析灵敏度方面，研究者评估了不同浓度的合成DNA和细菌裂解物，结果表明该技术能够检测到低至1皮克（pg）的合成DNA和10^5 CFU/mL的细菌裂解物。这些结果进一步证明了该技术在不同样本类型中的高灵敏度和可靠性。

在前瞻性研究阶段，从医院收集了186份临床样本，并从家禽养殖场获得了300份环境样本。结果显示，临床样本中检测到30例VRE，其中28例为*vanA*阳性，而家禽样本中检测到9例LZRE，其中8例为*optrA*阳性。这些数据表明，该多色PCR技术在检测VRE和LZRE基因方面表现出较高的准确性和特异性，特别是在LZRE检测中，其灵敏度达到88.9%，特异性为100%，准确率为97.1%。这表明该技术在实际应用中具有很高的诊断价值。

研究还发现，VRE的检测与样本类型显著相关（χ2 = 8.77，p = 0.033），其中血液样本的检测率最高。相比之下，家禽样本中LZRE的检测率较低，仅为3.0%。这提示我们，虽然家禽是耐药菌株的潜在来源，但其在环境中分布较为均匀，未表现出显著的区域差异。此外，VRE的检测还与样本的来源有关，如医院的不同科室，特别是医疗科室和急诊科，显示了较高的VRE检测率。

从统计学角度看，该多色PCR技术在检测VRE和LZRE基因方面表现优异。对于VRE检测，其灵敏度为71.8%，特异性为100%，准确率为83.6%。而对于LZRE检测，其灵敏度为88.9%，特异性为100%，准确率为97.1%。这些数据表明，该技术不仅在检测效率上具有优势，而且在减少假阳性假阴性方面也表现良好。特别是，对于LZRE检测，其假阴性率仅为1%，这表明该技术在检测这类耐药基因时具有很高的可靠性。

研究还强调了样本选择的重要性。血液样本显示出最高的VRE检测率（25.0%），这可能与血液感染的高发生率有关。相比之下，尿液样本的VRE检测率较低（5.7%），这可能与检测偏倚或样本处理方式有关。此外，研究还发现，VRE的检测与年龄、性别和种族之间没有显著相关性，这提示我们，耐药性可能更多地受到环境和医疗实践的影响，而非个体的生物因素。

从技术角度来看，多色PCR技术的高灵敏度和特异性使其成为一种理想的分子诊断工具。然而，该技术也存在一定的局限性。例如，对于某些耐药基因，其检测限（LOD）较高，尤其是在细菌水平上，这可能影响其在临床样本中的应用效果。此外，虽然该技术能够检测出多种耐药基因，但目前仅覆盖了部分已知的耐药基因，未来可能需要扩展检测范围以提高其全面性。

综上所述，本研究开发的多色PCR技术在检测肠球菌中的耐药基因方面表现出良好的性能，为全球范围内的耐药性监测提供了新的方法。该技术的高灵敏度和特异性使其能够快速、准确地识别耐药菌株，从而为医院感染控制和公共卫生政策提供支持。然而，为了进一步提高该技术的适用性，仍需在样本处理、基因检测范围和检测方法等方面进行优化和改进。未来的研究可以探索更大规模的样本数据，以增强统计分析的可信度，并评估该技术在不同地理环境和医疗条件下的表现。同时，结合临床数据和培养基确认，可以进一步提高诊断的准确性，确保在实际应用中能够全面覆盖各种耐药性情况。