基因交换的实验系揭示了线粒体和核突变对栗色拟步甲（Tribolium castaneum）磷化物抗性的定量影响

《Pesticide Biochemistry and Physiology》：Gene-swapped lines reveal quantitative contributions of mitochondrial and nuclear mutations to phosphine resistance in Tribolium castaneum

PH3抗性机制研究中构建了携带mtDNA突变、TcDld（P45S/N18D）及TcCytb5r（2-bp缺失）的基因置换品系，发现三者协同作用使抗性比率达263倍，mtDNA单独贡献弱（RR≈2.5），TcDld突变贡献显著（RR≈30）但不足，RNAi验证显示TcDld敲低致死率高而TcCytb5r敲低无害，提示多基因协同调控机制。

　　磷化氢（PH?）是一种广泛用于全球粮食储存保护的熏蒸剂，其简单化学结构使其成为一种重要的化学工具。然而，由于其广泛使用，PH?在储粮害虫中诱导了显著的抗性，对全球粮食储备构成了威胁。这种抗性的出现促使研究者寻找新的控制策略，但PH?仍然是唯一可行的熏蒸剂，因为它在残留物方面具有优势，并且在储粮产品中表现出高效、经济且无残留的特性。因此，深入理解PH?抗性的机制对于有效的害虫控制至关重要。

在昆虫学研究中，红 flour 蟑螂（*Tribolium castaneum*）作为一种重要的模式生物，因其在发育生物学、遗传学和害虫管理研究中的重要性而受到关注。该蟑螂是全球储粮产品的主要害虫，因此在研究PH?抗性机制方面具有高度的相关性。*T. castaneum*在实验室研究中具有诸多优势，包括较短的世代周期、简单的饲养需求以及完全测序的基因组。特别是，*T. castaneum*是首个被测序的鞘翅目昆虫，这为识别与抗性相关的遗传变异提供了重要的基因组资源。

此外，*T. castaneum*在分子研究中具有独特的价值，因为它具有强大的系统性RNA干扰（RNAi）反应，这种反应具有较长的持续时间，使得基因敲除实验变得高效，常能产生与基因敲除相似的表型。因此，该蟑螂特别适合于研究核基因和线粒体基因之间的复杂相互作用，这些基因共同影响PH?抗性。

目前，大多数杀虫剂的设计都针对特定的靶点，而PH?抗性则涉及多种不同的机制，包括广泛的靶点变异、敲击机制以及表皮变异。与大多数杀虫剂不同，PH?抗性并非仅由单一基因变异引起，而是由多个基因和线粒体DNA（mtDNA）的变异共同作用的结果。例如，二氢硫辛酸脱氢酶（Dld）作为线粒体代谢的核心酶，其变异与PH?抗性密切相关。在*T. castaneum*中，Dld的P45S突变已被广泛报道为PH?抗性获得的主要机制，并且在多个研究中被确认为关键因素。同样，细胞色素b5还原酶（Cytb5r）的变异也与PH?抗性有关，尽管其遗传变异在不同种群中表现出不规则的模式。

为了更全面地理解这些遗传因素对PH?抗性的具体贡献，本研究构建了基于同源遗传背景的新型基因交换品系。通过交叉策略，我们创建了四种不同的品系：（1）mtDNA突变品系，其核基因保持野生型，以估计mtDNA的影响；（2）Dld突变品系（如P45S），其mtDNA和Cytb5r保持野生型，以单独评估Dld突变的影响；（3）在Cytb5r上存在变异的品系；以及（4）携带所有相关突变的品系，以评估综合影响。这些品系被暴露于20小时的PH?熏蒸，以确定致死浓度（LC）值，并据此计算抗性比（RR），从而比较其个体和综合贡献。

此外，我们还评估了这三个遗传因素在品系中的特定基因表达，并通过基于RNAi的基因敲除实验，研究了基因调控对PH?抗性的具体贡献。结果显示，mtDNA突变单独作用时，仅能提供较弱的抗性（mR-dS vs mS-dS: RR ≈ 2.5），而Dld突变（如N18D和P45S）单独作用时，提供了显著但仍然较弱的抗性（mS-dR2 vs mS-dS: RR ≈ 30）。然而，Dld突变并不能单独解释极端的抗性表型。另一方面，Cytb5r的基因敲除导致了严重的死亡，而其敲除对抗性的影响则较为温和，表明Cytb5r的表达下降或突变本身可能不会直接导致死亡，但可能与其他抗性因素协同作用，从而增强抗性。当所有三个因素（mtDNA突变、Dld突变和Cytb5r突变）被同时引入时，PH?抗性达到了最大值（mR-dR vs mS-dS: RR ≈ 263）。这表明，核基因和线粒体基因在极端PH?抗性中具有协同作用，而我们构建的新型基因交换品系为量化这些因素的个体和综合贡献提供了关键数据，为抗性机制的研究提供了新的见解，并有助于制定更有效的害虫控制策略。

在PH?抗性研究中，线粒体DNA（mtDNA）的变异被认为是潜在的抗性机制之一。在*T. castaneum*的抗性品系中，已经鉴定出13个mtDNA点突变，这些突变分布在电子传递链（ETC）相关的基因中，包括编码NADH脱氢酶亚基2、3、4L和5的基因（TcNad2、TcNad3、TcNad4l和TcNad5），细胞色素b（TcCob），细胞色素c氧化酶亚基3（TcCox3），以及ATP合成酶亚基6和8的基因（TcAtp6和TcAtp8）。这些mtDNA突变可能影响线粒体的能量转换过程，从而对PH?抗性产生影响。然而，这些突变的具体作用机制仍需进一步研究。

在PH?抗性中，Dld突变（如P45S和N18D）和Cytb5r突变（如2-碱基缺失）都显示出一定的抗性贡献。然而，Dld突变单独作用时的抗性水平仍然有限，而Cytb5r突变虽然对抗性有贡献，但其影响较为温和。这表明，Dld和Cytb5r的突变可能与其他抗性因素协同作用，从而增强PH?抗性。此外，RNAi技术的应用使得研究者能够更精确地评估这些基因在抗性中的具体作用，同时也为理解基因调控对PH?抗性的贡献提供了新的方法。

本研究的结果表明，PH?抗性并非由单一基因或线粒体DNA变异引起，而是由多个因素共同作用的结果。通过构建同源遗传背景的基因交换品系，我们能够更精确地量化这些因素的个体和综合贡献。这不仅有助于理解PH?抗性的机制，也为开发新的害虫控制策略提供了理论基础。此外，研究结果还表明，基因调控在PH?抗性中具有重要作用，而RNAi技术的应用为研究这些调控机制提供了有力工具。

在实际应用中，PH?抗性研究的成果对于制定有效的害虫管理策略具有重要意义。通过了解不同基因和线粒体DNA变异对PH?抗性的具体贡献，研究者可以更准确地预测害虫的抗性发展，并开发针对性的控制措施。例如，针对Dld和Cytb5r的基因调控可能成为未来抗性管理的新方向，而mtDNA变异的识别则有助于评估害虫的遗传多样性及其对PH?抗性的潜在影响。此外，本研究还为基因交换技术的应用提供了新的思路，这种技术在昆虫遗传学研究中具有广泛的应用前景。

在当前的害虫控制策略中，PH?仍然是重要的工具之一。然而，随着PH?抗性的不断增加，研究者需要寻找新的方法来应对这一挑战。本研究的结果表明，通过基因交换技术构建的品系可以更有效地量化不同基因和线粒体DNA变异对PH?抗性的具体贡献，从而为抗性机制的研究提供新的数据。此外，研究结果还表明，基因调控在PH?抗性中具有重要作用，而RNAi技术的应用为研究这些调控机制提供了有力工具。

未来的研究方向可能包括进一步探索Dld、Cytb5r和mtDNA变异之间的相互作用机制，以及评估这些变异在不同害虫种群中的分布情况。此外，研究者还可以利用基因交换技术，构建更多的品系，以更全面地了解PH?抗性的遗传基础。这些研究不仅有助于理解PH?抗性的机制，也为开发新的害虫控制策略提供了理论支持。

总之，PH?抗性是一个复杂的遗传现象，涉及多个基因和线粒体DNA变异的相互作用。通过构建基于同源遗传背景的基因交换品系，研究者能够更精确地量化这些因素的个体和综合贡献，从而为抗性机制的研究提供新的数据。此外，研究结果还表明，基因调控在PH?抗性中具有重要作用，而RNAi技术的应用为研究这些调控机制提供了有力工具。这些研究不仅有助于理解PH?抗性的机制，也为开发新的害虫控制策略提供了理论支持。