从污染土壤中分离高产聚羟基脂肪酸酯生产菌及其生物聚合物特性研究

《Scientific Reports》：Isolation of high yield polyhydroxyalkanoate producing bacteria from contaminated soils and biopolymer characterization

本研究针对合成塑料造成的严峻环境问题，从巴基斯坦石油污染土壤中成功分离出五株高产聚羟基脂肪酸酯(PHA)的细菌菌株。研究人员通过优化培养条件，使PHA产量最高达到细胞干重的70.44±0.08%，并利用FTIR和1H NMR技术证实所产PHA为PHB和PHBV共聚物。该研究为开发可生物降解的环保生物塑料提供了新的菌种资源和理论依据，对推动绿色生物制造具有重要意义。

　　

在我们生活的这个塑料时代，从食品包装到医疗器械，合成塑料几乎无处不在。然而，这些以石油为原料的塑料制品在带来便利的同时，也造成了严重的环境危机。传统的塑料极难自然降解，可以在环境中存留数百年之久，而焚烧处理又会释放大量温室气体和有毒物质。据统计，全球每年生产的塑料高达约1.8亿吨，其中大量最终进入海洋和陆地生态系统，对生态环境和人类健康构成严重威胁。

面对这一全球性挑战，科学家们将目光投向了自然界中的解决方案——寻找可以替代传统塑料的可生物降解材料。其中，聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoates, PHA)作为一种由微生物合成的生物聚酯，展现出巨大潜力。这些微生物在碳源过剩而氮、磷等营养元素受限的条件下，会在细胞内积累PHA作为碳和能量的储存物质。PHA不仅具备与传统塑料相似的热塑性性能，还具有生物可降解性和生物相容性，被认为是石油基塑料的理想替代品。

尽管已有超过300种细菌和古菌被报道能够产生PHA，但从不同环境中发掘高产菌株、优化生产条件仍是当前研究的重点。特别是在巴基斯坦这样的地区，利用本地微生物资源开发生物塑料技术，对于解决塑料污染问题和促进可持续发展具有重要意义。

在这一背景下，Maria Abdul Salam等人开展了一项创新性研究，从巴基斯坦拉瓦尔品第的石油污染土壤中分离筛选高产PHA的细菌菌株，并对产生的生物聚合物进行系统表征。他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为开发环保型生物塑料提供了新的菌种资源和理论依据。

研究人员主要运用了几项关键技术方法：从巴基斯坦拉瓦尔品第三个不同污染场地采集土壤样品，通过富集培养和稀释涂布法分离细菌；使用苏丹黑B染色法进行PHA生产的初步筛选；通过16S rRNA基因测序对菌株进行分子鉴定；采用单因素优化法确定最佳培养条件（pH、温度、碳氮源、培养时间）；通过十二烷基硫酸钠(SDS)法提取PHA；利用傅里叶变换红外光谱(FTIR)和质子核磁共振(¹H NMR)对PHA进行结构表征。

筛选和鉴定选定的细菌菌株

研究人员从污染土壤中分离出12株细菌，通过苏丹黑B染色初步筛选出5株PHA产量较高的菌株（MA2、MA3、MB1、MB4和MC3）。经16S rRNA基因序列分析鉴定，这些菌株分别为Paenibacillus lautus (MA2)、Alcaligenes pakistanensis (MA3)、Acinetobacter baumannii (MB1)、Bacillus cereus (MB4)和Bacillus tropicus (MC3)。这些菌株均显示出丰富的细胞内脂质内含物，表明具有较强的PHA合成能力。

选定分离株的抗生素敏感性谱

抗生素敏感性测试显示，不同菌株对抗生素的反应存在显著差异。萘啶酸对大多数菌株表现出高敏感性（87%-99%），而氨苄西林对某些菌株的效果较差。特别值得注意的是，MC3菌株对几乎所有测试的抗生素都高度敏感，而MB1和MB4对多种抗生素表现出耐药性。这些信息对于工业规模生产中的生物安全控制和菌株选择具有重要意义。

酶活性评估

研究人员评估了所有菌株的水解酶活性，包括淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶和纤维素酶。结果显示，具有强PHA积累能力的菌株通常也表现出较高的水解酶活性。例如，MA3和MB4不仅PHA产量高，还具有高蛋白酶活性；MA2和MC3则表现出中度的淀粉酶和脂肪酶活性。这表明这些菌株具有代谢多样性，能够利用多种有机底物进行PHA合成。

理化参数优化

通过系统优化培养条件，研究人员发现所有菌株在最适pH为7.0、温度35-40°C时生长最佳。葡萄糖是最有效的碳源，而胰蛋白胨是最佳氮源。培养时间对PHA积累至关重要，在60-72小时达到峰值，其中72小时被选为最佳收获时间。在优化条件下，菌株MA2、MA3和MC3的PHA产量最高，达到细胞干重的60%-70%。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)

FTIR分析检测到PHA样品的特征吸收带：1723-1740 cm^-1（C=O伸缩振动，酯基）、2922-2923 cm^-1（CH₂不对称伸缩振动）、1634 cm^-1（C=C双键）和1231-1278 cm^-1（C-O伸缩振动，醚或酯键）。这些特征峰证实了所提取的生物聚合物具有PHA的典型结构特征，与已知的聚(3-羟基丁酸酯)(PHB)和聚(3-羟基丁酸酯-co-3-羟基戊酸酯)(PHBV)结构一致。

质子核磁共振(¹H-NMR)

¹H-NMR分析进一步证实了PHA的共聚物结构。3-羟基丁酸酯(3HB)单体的特征信号出现在δ=1.28 ppm（甲基-CH₃）、δ=2.56 ppm（邻近羰基的亚甲基-CH₂-）和δ=5.25 ppm（连接氧原子的次甲基-CH-）。3-羟基戊酸酯(3HV)单体的信号出现在δ=0.9 ppm（末端-CH₃）、δ=1.6-1.8 ppm（亚甲基质子-CH₂-）和δ=2.4-2.6 ppm（邻近羰基的亚甲基）。这些明确的信号峰证实了3HB和3HV单元成功共聚到聚合物骨架上，验证了PHA的共聚物性质。

本研究成功从巴基斯坦石油污染土壤中分离出五株高产PHA的细菌菌株，并通过优化培养条件显著提高了PHA产量。结构表征证实所产PHA为PHB和PHBV的共聚物，具有典型的酯基、烷基等官能团特征。3HV单体的引入可以降低聚合物的结晶度，改善其机械性能和加工性能，使其更适合生物医学和包装等领域的应用。

这些本土分离的菌株不仅PHA产量高，而且具有代谢多样性，能够利用多种碳源，为低成本、可持续的PHA生产提供了有前景的微生物资源。该研究填补了巴基斯坦地区PHA生产菌种资源研究的空白，为开发环境友好型生物塑料替代传统塑料提供了科学依据，对推动生物塑料产业发展和解决白色污染问题具有重要意义。

特别是菌株Bacillus tropicus (MC3)表现出最高的PHA产量和对抗生素的敏感性，这为其在工业应用中的生物安全性提供了保障。未来研究可以进一步探索这些菌株利用工农业废弃物作为低成本底物生产PHA的潜力，以及通过代谢工程手段提高PHA产量和调控共聚物组成，从而获得具有特定性能的定制化生物材料。