TESMIN通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路促进肺腺癌增殖、迁移和侵袭的机制研究

《Scientific Reports》：TESMIN promotes lung adenocarcinoma proliferation, migration and invasion via PI3K/AKT/mTOR signaling

本研究聚焦肺腺癌缺乏有效生物标志物的临床难题，发现TESMIN在肺腺癌中显著高表达且与不良预后相关。通过功能实验证实TESMIN可促进肿瘤细胞增殖、迁移和侵袭，并首次揭示其通过激活PI3K/AKT/mTOR信号通路驱动肿瘤进展的分子机制。研究为肺腺癌靶向治疗提供了新的生物标志物和潜在治疗靶点。

　　

肺腺癌作为全球癌症相关死亡的主要原因之一，尽管在分子分型和靶向治疗/免疫治疗方面取得了进展，但患者的生存获益仍然有限，复发和转移频繁发生，这凸显了对既能预测预后又能揭示可行作用机制的生物标志物的迫切需求。在致癌网络中，PI3K/AKT/mTOR（PAM）通路在非小细胞肺癌（NSCLC）中显著激活，驱动肿瘤发生、进展和治疗抵抗。然而，该通路单药抑制剂在未加选择的非小细胞肺癌人群中疗效有限，突出了对基于生物学基础的患者选择和联合策略的需求。

TESMIN（也称为MTL5）是一种半胱氨酸丰富的金属硫蛋白样蛋白，最初在生殖细胞中被鉴定。近年来，异常TESMIN表达在多种恶性肿瘤中被报道，包括非小细胞肺癌和一些胸外肿瘤，其中较高的TESMIN水平与不良临床病理特征以及增强的增殖和侵袭行为相关。这些观察结果支持了TESMIN的促肿瘤作用，但将TESMIN与肺腺癌恶性表型联系起来的上游-下游信号逻辑仍然定义不足。特别是，TESMIN是否参与PI3K/AKT/mTOR级联反应，以耦合mTORC1依赖性翻译程序与mTORC2/Rho驱动的肌动蛋白重塑，从而协调增殖与迁移和侵袭能力，尚属未知。

为了填补这一空白，研究人员在TCGA-LUAD（癌症基因组图谱-肺腺癌）队列和配对临床组织中分析了TESMIN的表达及其临床关联，在肺腺癌细胞模型中进行功能获得和功能缺失研究，绘制了PI3K/AKT/mTOR磷酸化状态图谱，并使用PI3K抑制剂（GDC0941）和AKT抑制剂（MK2206）测试了节点特异性依赖性。此外，还评估了细胞骨架重塑和体内肿瘤生长，旨在明确TESMIN在肺腺癌中的生物学作用，并评估其作为预后生物标志物和PAM导向干预措施分层依据的潜力。

研究发现，TESMIN在肺腺癌组织中表达显著上调，且与较差的总生存期相关。功能上，TESMIN增强了肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和肌动蛋白重塑能力。机制上，TESMIN增加了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化，而不改变其总蛋白水平。使用GDC0941（PI3K抑制剂）或MK2206（AKT抑制剂）进行药理学阻断，可降低通路磷酸化水平，并逆转TESMIN驱动的增殖、运动、侵袭性和细胞骨架重组。在体内，TESMIN过表达加速了异种移植瘤的生长，而其敲低则抑制了肿瘤生长。这些多层次的数据表明TESMIN通过功能性激活PI3K/AKT/mTOR通路促进肺腺癌进展，提名TESMIN作为一个预后生物标志物和基于生物学的肺腺癌候选靶点。

本研究主要关键技术包括：利用TCGA-LUAD公共数据集进行生物信息学分析；临床组织样本的免疫组织化学和蛋白质印迹验证；在肺腺癌细胞系（H1299, H292）中进行稳定基因操作（过表达和敲低）及功能表型检测（CCK-8、EdU、伤口愈合、Transwell实验）；RNA测序及GO/KEGG富集分析；针对PI3K/AKT/mTOR通路的磷酸化蛋白水平检测及药理学抑制（使用GDC0941和MK2206）；细胞骨架F-肌动蛋白荧光染色及定量；以及小鼠皮下异种移植瘤和实验性肺转移模型评估体内肿瘤生长和转移能力。

TESMIN在肺腺癌中表达上调并与不良预后相关

研究人员首先评估了TESMIN在TCGA-LUAD队列中的表达。结果显示，TESMIN mRNA水平在肿瘤组织中显著高于癌旁正常组织。Kaplan-Meier生存分析显示，高TESMIN表达与显著较差的总生存期相关。与不良临床病理特征（如生存状态、淋巴结转移（N分期）、远处转移（M分期）和总体病理分期）存在关联。在蛋白水平上，对配对肺腺癌和癌旁正常肺组织进行的蛋白质印迹和免疫组织化学分析证实了TESMIN在肿瘤中的显著增加。这些发现表明TESMIN在肺腺癌中持续上调，可能作为潜在的预后生物标志物。

TESMIN敲低减弱肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

鉴于TESMIN在肺腺癌中的显著上调，研究人员假设其具有促癌作用。在肺腺癌细胞系中的qRT-PCR（定量实时聚合酶链式反应）调查揭示了TESMIN的差异表达，H292细胞表达较高，H1299细胞表达较低。因此，选择H292细胞进行功能缺失实验。通过慢病毒shRNA（短发夹RNA）实现了稳定的TESMIN敲低，并通过qRT-PCR和蛋白质印迹在mRNA和蛋白水平进行了验证。功能上，TESMIN敲低显著降低了通过CCK-8和EdU（5-乙炔基-2'-脱氧尿苷）实验测量的细胞增殖，并在伤口愈合和Transwell迁移/侵袭实验中抑制了运动性和侵袭性。这些发现支持了TESMIN通过维持增殖和运动表型在肺腺癌细胞中发挥促肿瘤作用。

TESMIN过表达促进肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭

为了进一步评估TESMIN的致癌潜力，在内源性TESMIN表达较低的H1299细胞中建立了稳定过表达模型。通过qRT-PCR和免疫印迹证实了过表达的成功。TESMIN过表达显著增加了细胞增殖，表现为CCK-8信号增强和EdU掺入增加。同时，伤口愈合和Transwell实验证明了其迁移和侵袭能力的增强。这些数据表明TESMIN作为肺腺癌细胞增殖和运动的阳性调节因子，支持其促肿瘤作用。

TESMIN与肺腺癌细胞中的细胞骨架重塑相关

为了探究TESMIN相关进展的机制，研究人员根据TESMIN表达对TCGA-LUAD肿瘤进行分层，并进行了差异表达和基因本体论富集分析。TESMIN高表达的肿瘤显示出与纤毛组装、微管基础运动和细胞骨架组织相关过程的显著富集。受这些转录组信号的指导，研究人员随后检查了细胞模型中的肌动蛋白结构。在NCI-H1299细胞中，与对照组相比，TESMIN过表达增加了膜丝状伪足样突起，并通过鬼笔环肽染色产生了更有序的F-肌动蛋白束，这与增强的肌动蛋白重塑和迁移能力一致。这些数据表明TESMIN在功能上与细胞骨架动力学的重编程相关，并可能至少部分通过基于肌动蛋白的重塑促进肺腺癌细胞的运动和侵袭性。

TESMIN促进体内肿瘤生长和实验性肺定植

为了进一步评估TESMIN的致癌功能，在BALB/c裸鼠中建立了皮下异种移植瘤模型。与阴性对照细胞相比，稳定过表达TESMIN的H1299细胞在实验终点形成了显著更大的肿瘤。相反，在H292细胞中敲低TESMIN导致肿瘤体积相对于shNC对照显著减小。这些体内发现与体外数据一致，表明TESMIN是肺腺癌肿瘤生长的关键促进因子，支持其作为治疗靶点的潜力。为了探究体内转移能力，研究人员进行了实验性转移测定，通过尾静脉注射将H1299-TESMIN-OE或H1299-NC细胞注入BALB/c裸鼠，14天后收集肺部。大体检查和代表性图像显示TESMIN-OE组肺表面结节更多，定量证实了相对于NC的肺定植显著增加。这些体内发现与体外数据一致，表明TESMIN促进肺腺癌肿瘤生长和转移定植/殖民化，支持其作为治疗靶点的潜力。

TESMIN激活肺腺癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR通路

为了阐明TESMIN的致癌机制，在稳定过表达TESMIN的H1299细胞中进行了RNA测序。转录组谱显示广泛改变，KEGG富集分析突出了癌症相关级联的显著上调，特别是PI3K/AKT和MAPK通路。在蛋白水平上，免疫印迹证明TESMIN过表达增加了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化，而不影响其总蛋白水平。相反，在H292细胞中敲低TESMIN显著降低了这些信号成分的磷酸化。这些发现表明TESMIN激活了肺腺癌细胞中的PI3K/AKT/mTOR信号轴。

PI3K/AKT抑制剂减弱TESMIN依赖的分子和表型输出

在具有低内源性TESMIN的NCI-H1299细胞中，研究人员使用药理学上位性测试TESMIN驱动的信号是否可逆，从而依赖于PI3K/AKT。正如低基础PAM活性所预期的那样，NC与NC+抑制剂在暴露窗口内显示最小变化。信息丰富的对比是TESMIN-OE与TESMIN-OE+抑制剂：用PI3K抑制剂GDC-0941预处理降低了相对于未处理OE细胞的p-PI3K、p-AKT和p-mTOR，总蛋白水平不变。用AKT抑制剂MK-2206预处理主要降低了p-AKT和p-mTOR，对p-PI3K影响很小，这与PI3K-AKT-mTOR级联内的节点特异性中断一致。功能上，两种抑制剂都减弱了TESMIN-OE相关的增殖（CCK-8活力和EdU掺入减少），并且双因素方差分析检测到显著的TESMIN X抑制剂相互作用，表明通路阻断抵消了TESMIN过表达赋予的增殖优势。关于运动和侵袭，两种抑制剂都降低了Transwell迁移/侵袭并减缓了伤口闭合。一致地，鬼笔环肽染色显示在抑制剂处理后，TESMIN-OE细胞骨架特征（增加的丝状伪足样突起和应力纤维）发生逆转。

综上所述，本研究将TESMIN鉴定为肺腺癌中的促肿瘤因子。TESMIN在肿瘤中上调并与较差的总生存期相关；功能获得和功能缺失实验证明TESMIN在体外增强增殖、迁移和侵袭，并在体内加速异种移植瘤生长。机制上，TESMIN增加了PI3K、AKT和mTOR的磷酸化，而不改变总蛋白丰度，并且在PI3K（GDC0941）或AKT（MK2206）处的节点特异性通路中断减弱了信号传导和恶性表型。这些数据将TESMIN置于PAM轴的上游，并表明通路活性是TESMIN在肺腺癌中产生生物学输出所必需的。

PI3K/AKT/mTOR通路的异常激活是实体瘤中最常见的致癌事件之一，并与非小细胞肺癌的生物学和治疗抵抗密切相关。典型地，mTORC1通过激活S6K/S6和解除4E-BP1对帽依赖性翻译的抑制，将生长因子和营养输入与生物合成需求耦合，从而加速核糖体生物合成、合成代谢和细胞周期进程。与这一范式一致，TESMIN过表达与增加的p-mTOR和下游读数相吻合，而PI3K/AKT阻断在肺腺癌模型中同时抑制了信号传导和增殖，支持了TESMIN通过mTORC1依赖性翻译程序维持生长的机制。

除了增殖，PAM信号通过重塑肌动蛋白细胞骨架来编程细胞运动。mTORC2是AKT-Ser473的生理激酶，是F-肌动蛋白结构的既定组织者；通过与Rho家族GTP酶和PKC整合，mTORC2控制应力纤维、膜皱褶和细胞形状以促进迁移和侵袭。观察到的TESMIN依赖性丝状伪足样突起和应力纤维的增加（被PI3K或AKT抑制逆转）与这些文献一致，并表明TESMIN利用PAM信号将细胞骨架动力学偏向于运动、侵袭状态。这种细胞骨架重编程是侵袭伪足形成和组织浸润的公认先决条件。

PAM信号增强侵袭性的一个补充途径是上皮-间质转化（EMT）。AKT抑制GSK-3β活性，稳定并核保留EMT驱动因子Snail（及相关因子），从而抑制上皮粘附并促进运动和传播。虽然此处未直接量化EMT转录调节因子，但本文记录的TESMIN→PI3K/AKT激活为EMT相关可塑性提供了合理的上游背景，与细胞骨架和侵袭表型一致。

在非小细胞肺癌中，PAM激活（通过遗传病变或非遗传重编程）与侵袭性疾病、EMT、转移倾向和治疗失败相关。尽管单药PI3K/AKT/mTOR抑制剂在未加选择的非小细胞肺癌人群中显示有限活性，但类别选择性药物（例如变构AKT抑制剂）显示出通路上的药效学效应和情境依赖性益处；合理的组合正在积极研究中。TESMIN高表达细胞对PI3K/AKT中断的药理学脆弱性表明，TESMIN可能作为PAM导向干预措施的基于生物学的分层标志物，这一观点值得在更广泛的肺腺癌组合和带注释的患者队列中进行评估。

总之，抑制剂敏感的磷酸化而不改变总PI3K/AKT/mTOR最符合TESMIN的上游“许可”作用，而不是下游反馈。基于这些观察，研究人员概述了TESMIN如何参与PAM的三种非排他性、数据一致的模型。因此，研究人员将TESMIN解释为在上游调节因子，在测试条件下许可PAM激活，而精确的近端节点仍有待定位。

总之，研究数据支持一个模型，其中TESMIN激活PI3K/AKT/mTOR，将mTORC1介导的翻译输出与mTORC2/Rho驱动的细胞骨架程序耦合，以驱动增殖、迁移和侵袭。局限性包括使用两种肺腺癌细胞背景，缺乏TESMIN与近端PAM输入（衔接子复合物或脂质信号节点）之间的直接生化作图，因此即时耦合位点仍未解决；药理学上位性无法排除汇聚于AKT/mTOR的平行或补偿输入；缺乏终点时的肿瘤水平磷酸读数，这些读数易受分析前变异性的影响；以及当前模型中缺乏PI3K亚型特异性和mTORC1与mTORC2的区分。未来的研究应（i）定义TESMIN相互作用组和近端效应物以精确定位耦合节点；（ii）结合能够区分衔接子结合、脂质平衡和磷酸酶活性的测定，以及亚型选择性PI3K和mTORC1/2区分扰动；（iii）评估TESMIN表达与临床PAM活性读数，以完善患者选择和组合策略。

该研究发表于《Scientific Reports》期刊，为理解肺腺癌进展的分子机制提供了新的见解，并确定了TESMIN及其下游通路作为潜在的治疗干预靶点。