优化白蛋白结合域融合的促血小板生成素模拟肽以增强生物活性并延长半衰期

《Scientific Reports》：Optimization of thrombopoietin mimetic peptide fusion proteins with albumin-binding domain for enhanced bioactivity and extended half-life

本研究针对促血小板生成素模拟肽（TMP）因快速清除导致的半衰期短问题，通过基因工程构建了与白蛋白结合域（ABD）融合的TMP二聚体（2C-ABD-2TMP）和单体（A-ABD-2TMP）。研究证实融合蛋白具有高热稳定性（70℃）、高HSA亲和力（EC50=2.1 nM），在MO7e细胞增殖实验和小鼠模型中显示出优于单独2TMP的促血小板生成活性，并将半衰期从~1小时显著延长至17.6小时，为ITP治疗提供了新策略。

　　

在血液疾病的广阔版图上，免疫性血小板减少症（ITP）是一种令人困扰的自身免疫性疾病，其特征是血小板被加速破坏，同时生成不足，导致患者面临严重的出血风险。血小板生成素（TPO）是体内调控血小板生成的核心因子，它通过与巨核细胞表面的c-Mpl受体结合，启动一系列信号传导，促进血小板的成熟与释放。然而，直接使用重组TPO存在诱发中和抗体的风险。为此，科学家们开发出了TPO模拟肽（TMP），这类小分子肽能够模拟TPO的功能，有效激活c-Ml受体，且因其与内源性TPO序列同源性低，免疫原性风险较小。但TMP分子量极小（约1.6 kDa），在体内会通过肾脏被迅速清除，半衰期极短，仅约1小时，这严重限制了其临床应用，通常需要频繁给药，影响了患者的依从性和治疗效果。

为了攻克这一难题，蛋白质工程领域常采用半衰期延长策略。例如，将治疗性蛋白与抗体的Fc片段或人血清白蛋白（HSA）本身融合，可以借助新生儿Fc受体（FcRn）介导的循环途径，显著延长其在血液中的存留时间。现有的TPO受体激动剂如罗米司亭（Romiplostim，一种Fc-TMP融合蛋白）就是成功的临床应用，但它需要每周给药，且其生产过程涉及复杂的真核表达系统或包涵体复性，成本较高。近年来，一种名为白蛋白结合域（ABD）的小分子支架展现出巨大潜力。ABD源自链球菌G蛋白，是一个仅约5-6 kDa的三螺旋束，能以纳摩尔级的高亲和力与HSA结合，从而间接利用FcRn回收机制延长半衰期。更重要的是，ABD分子小，易于在原核系统（如大肠杆菌E. coli）中进行可溶性表达，大大降低了生产成本并避免了糖基化等翻译后修饰可能带来的问题。

发表在《Scientific Reports》上的这项研究，正是基于这一背景，旨在通过巧妙的分子设计，优化TMP与ABD的融合蛋白，以期同时实现高效表达、长效循环和高效活性。研究人员设想，将TMP与ABD融合，不仅能借助ABD与HSA的结合延长半衰期，还可能通过构建多价形式的融合蛋白来增强其与c-Mpl受体的结合能力，从而提升生物活性。

为了验证这一设想，研究团队开展了一系列严谨的实验。本研究的关键技术方法主要包括：利用分子克隆技术构建含有不同接头（Linker）和半胱氨酸（Cys）或丙氨酸（Ala）突变点的融合蛋白表达载体；在大肠杆菌BL21(DE3)中利用硫氧还蛋白（Trx）标签促进可溶性表达，并通过镍柱（Ni2+-NTA）亲和层析和离子交换层析进行多步纯化；采用圆二色（CD）光谱分析蛋白热稳定性，酶联免疫吸附试验（ELISA）检测与HSA的亲和力，MO7e细胞增殖实验评估体外生物活性，并在C57BL/6小鼠模型中评估其药代动力学参数和刺激血小板生成的能力。

3. 结果

3.1 质粒构建

研究人员成功构建了两种融合蛋白表达载体。核心设计在于：将两个TMP序列以八甘氨酸（8×Gly） linker串联，再通过一个五甘氨酸（5×Gly） linker与ABD035（一种高亲和力ABD变体）的C端融合。在ABD的N端，引入了包含一个半胱氨酸（Cys）的“CGGGGSGGS”柔性接头，以便在纯化后形成分子间二硫键，从而得到二聚体融合蛋白（命名为2C-ABD-2TMP）。作为对照，将Cys突变为Ala，则得到不能形成二聚体的单体融合蛋白（A-ABD-2TMP）。所有构建体均包含N端的His标签和Trx标签以促进可溶性表达和纯化，并在标签与ABD之间设计了凝血酶切割位点，以便在纯化后去除标签。

3.2 融合蛋白的表达与纯化

将构建好的质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)后，经IPTG诱导表达，融合蛋白均能以可溶形式高效表达。通过镍柱亲和层析初步纯化后，用凝血酶切割去除His-Trx标签，再经过第二次镍柱去除标签和未切割的蛋白，最后利用阳离子交换色谱进行精纯，获得了高纯度的目标蛋白。对于C-ABD-2TMP，在氧化谷胱甘肽（GSSG）/还原型谷胱甘肽（GSH） redox体系下成功促进了分子间二硫键的形成，得到了二聚体2C-ABD-2TMP。SDS-PAGE分析证实了蛋白的纯度和预期分子量。

3.3 融合蛋白的热稳定性分析

圆二色光谱分析显示，两种融合蛋白在200-260 nm波长范围内均呈现典型的α-螺旋特征峰（208 nm和222 nm处的负峰）。即使在20°C、45°C和70°C下进行扫描，其二级结构也未发生显著变化，表明融合蛋白具有优异的热稳定性。

3.4 融合蛋白与HSA的亲和力

通过ELISA法评估了融合蛋白与HSA的结合能力。结果显示，二聚体2C-ABD-2TMP与HSA结合的表观半数有效浓度（EC₅₀）为2.1 ± 0.6 nM，而单体A-ABD-2TMP的EC₅₀为5.5 ± 1.1 nM，表明二聚化显著增强了与HSA的亲和力。单独的2TMP肽则无法与HSA结合。

3.5 MO7e细胞增殖实验

在表达c-Mpl受体的MO7e细胞模型中，两种融合蛋白均能剂量依赖性地促进细胞增殖。在25 nM浓度下，2C-ABD-2TMP诱导的细胞增殖显著强于单独的2TMP肽（p < 0.01）和A-ABD-2TMP（p < 0.05）。即使在1 nM的低浓度下，2C-ABD-2TMP的促增殖活性也显著高于2TMP（p < 0.05），证明了其更高的体外生物活性。

3.6 对小鼠血小板生成的刺激作用

在小鼠体内实验中，皮下注射融合蛋白后，所有治疗组的血小板计数均显著高于PBS对照组。给予150 nmol/kg剂量的2C-ABD-2TMP后，血小板计数在第12天达到峰值（3.1 × 10⁹/mL），并且此升高效应可持续至第18天（仍高于2.4 × 10⁹/mL），显示出强效且持久的促血小板生成作用。曲线下面积（AUC）分析进一步证实，高剂量2C-ABD-2TMP组的总体效应显著优于2TMP组和A-ABD-2TMP组（p < 0.01）。

3.7 小鼠体内药代动力学研究

药代动力学研究显示，2C-ABD-2TMP在小鼠体内的半衰期达到17.6 ± 2.9小时，而A-ABD-2TMP的半衰期为13.2 ± 1.6小时。两者均显著长于2TMP单独给药约1小时的半衰期，甚至优于文献报道的Fc融合蛋白罗米司亭在小鼠中的半衰期（约12.5小时）。这充分证明了ABD融合策略在延长TMP半衰期方面的卓越效果。

4. 讨论与结论

本研究的成功之处在于，它不仅证实了ABD融合是延长TMP半衰期的有效策略，还通过巧妙的二聚体设计（2C-ABD-2TMP）进一步提升了融合蛋白的性能。二聚体结构可能通过增加与HSA的结合价态（可能结合两分子HSA），从而提高了亲和力并延长了半衰期。同时，二聚体结构可能更有利于介导c-Mpl受体的二聚化激活，从而表现出更强的体外和体内生物活性。研究中使用的柔性Gly linker有效减少了ABD与TMP功能域之间的空间位阻，保障了TMP与受体的有效结合。将TMP融合在ABD的C端，也被认为是保留其生物活性的一个有利取向。

与现有的TMP长效化策略相比，本研究开发的ABD-TMP融合蛋白展现出独特优势：相较于需要在真核系统表达的HSA融合蛋白或存在抗PEG抗体风险的PEG化修饰，本研究实现了在大肠杆菌中的高效可溶性表达，工艺简单，成本低廉；相较于同样在原核表达但易形成包涵体需要复杂复性过程的罗米司亭（Fc融合），本研究获得的融合蛋白半衰期更长，体内作用持续时间更久。

当然，研究也存在一些可进一步优化的空间，例如未来可以系统筛选不同长度和组成的linker，以期获得更优的活性和表达量；也可以在ITP疾病模型中进行功效验证，使其更贴近临床应用场景。

综上所述，这项研究成功设计并制备了两种具有高热稳定性和HSA高亲和力的TMP-ABD融合蛋白。其中，通过二硫键形成的二聚体2C-ABD-2TMP表现尤为突出，其在体外细胞模型和小鼠体内均展现出优于单体融合蛋白和单独TMP的促血小板生成活性，并实现了显著的半衰期延长。这为开发新一代高效、长效且生产成本更低的ITP治疗药物提供了有前景的候选分子和重要的实验依据。