结合多种代谢策略以高效地在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中生产长叶烯

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：Combining multiple metabolic strategies for efficient production of longifolene in Saccharomyces cerevisiae

长叶烯作为萜烯类化合物在生物燃料和香料生产中具有重要价值。本研究通过酶融合技术优化长叶烯合酶活性，结合丙酮酸旁路增强和柠檬酸裂解途径改造提升乙酰辅酶A前体供应，同时引入形式酸脱氢酶模块补充还原力，实现酵母发酵体系中长叶烯产量达2063.7 mg/L，刷新了当前最高产量的记录。

　　长叶烯是一种广泛存在于松树重质松脂油中的三环倍半萜类化合物，因其独特的化学结构和多功能特性，在多个领域具有重要应用。它不仅被用作合成香料的前体，如异长叶烯和异长叶烯酮，还在润滑剂和驱虫剂的生产中发挥作用。此外，长叶烯因其高密度和燃烧热值，被认为是一种潜在的新型航空燃料。然而，由于长叶烯在松脂油中通常与多种异构体共存，其纯度较低，而化学合成过程复杂，限制了其大规模生产。因此，开发一种高效、环保的生物合成方法成为研究的重点。

在本研究中，科研团队利用酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）作为细胞工厂，通过一系列代谢工程策略优化长叶烯的生产。首先，研究者采用了酶融合技术来增强长叶烯合酶的催化效率。这种技术通过将相邻酶的活性位点更接近，减少中间产物的扩散阻力，从而提高反应效率。实验结果显示，不同长度和类型的连接肽对融合蛋白的性能有显著影响，其中柔性连接肽GGGGS表现出最佳效果，使长叶烯产量提高了20%。进一步通过AlphaFold预测融合蛋白的结构，验证了连接肽在缩短底物通道、提升催化效率方面的潜在作用。

其次，研究团队通过调整丙酮酸旁路途径和引入合成的柠檬酸裂解途径，提升了细胞内乙酰辅酶A的可用性。乙酰辅酶A是倍半萜类化合物合成的关键前体，其浓度直接影响到长叶烯的产量。在酿酒酵母中，丙酮酸旁路途径是乙酰辅酶A合成的主要路径，通过增强该途径中关键酶的表达，能够有效增加乙酰辅酶A的生成。此外，引入柠檬酸裂解途径可以将线粒体中的柠檬酸转运至细胞质，并通过裂解生成乙酰辅酶A和草酰乙酸，从而进一步提升前体供应。实验表明，单独增强丙酮酸旁路途径的某些酶并不能显著提升长叶烯产量，但结合柠檬酸裂解途径的多个基因过表达后，产量显著增加，达到42.2毫克/升。

为了维持细胞内的还原状态，研究团队还引入了形式脱氢酶模块，以补充还原辅因子NAD(P)H。NAD(P)H是细胞内电子传递反应的重要载体，其水平直接影响到生物合成路径的进行。在本研究中，通过引入形式脱氢酶及其突变体，显著提升了细胞内的NAD(P)H供应，从而促进了长叶烯的合成。实验结果表明，引入*Pseudomonas* sp. 101的突变形式脱氢酶后，长叶烯产量达到62.5毫克/升，比对照组提高了2.28倍。

在综合多种策略的基础上，研究团队进一步优化了发酵条件，通过摇瓶发酵和分批补料发酵技术，使长叶烯产量大幅提升。在摇瓶实验中，通过优化酶融合、前体供应和还原辅因子再生策略，长叶烯产量达到了78.67毫克/升。随后，在5升生物反应器中进行分批补料发酵，产量进一步提高至2063.7毫克/升，这是目前报道的最高产量。这一结果不仅验证了多策略协同优化的有效性，也展示了酿酒酵母在长叶烯工业生产中的巨大潜力。

此外，研究还探讨了不同基因过表达对长叶烯产量的影响。例如，过表达丙酮酸脱氢酶（PDC1）和乙醇脱氢酶（ADH2）等基因，虽然在一定程度上提升了产量，但并未产生叠加效应，说明对丙酮酸代谢路径的过度调控可能带来代谢负担或还原状态失衡。因此，研究团队在综合考虑各代谢模块的协同作用后，选择了最优的组合策略，最终实现了长叶烯产量的显著提升。

本研究的意义在于，通过系统地解决长叶烯合成过程中的三个关键瓶颈——酶催化效率、前体可用性和辅因子再生，构建了一个高效的生物合成平台。这不仅为长叶烯的工业化生产提供了新的思路，也为其他萜类化合物的合成提供了参考。同时，研究结果表明，酿酒酵母作为工业菌株，具有良好的稳定性和成熟的基因编辑工具，能够胜任复杂的代谢工程任务。

在实验方法上，研究团队采用了多种分析手段，包括气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）用于测定长叶烯的产量，高效液相色谱（HPLC）用于检测葡萄糖和乙醇的浓度，以及紫外分光光度计用于测量细胞密度（OD600）。这些方法的结合，确保了实验数据的准确性和可靠性，为后续的优化提供了坚实的基础。

研究还提到，酵母菌株L12是基于CEN.PK 113-5D构建的底盘菌株，用于后续的代谢工程改造。通过构建和比较一系列ERG20-psTPS融合蛋白，研究团队发现连接肽的类型和长度对催化效率有重要影响。其中，含有GGGGS连接肽的融合蛋白在长叶烯合成中表现出最佳性能，这表明合理的连接肽设计能够有效提升酶的活性和稳定性。

在实际应用中，分批补料发酵技术被证明是提升长叶烯产量的关键手段。通过控制溶解氧水平、调节补料策略，研究团队在5升生物反应器中实现了长叶烯产量的突破。这一成果不仅体现了酵母菌株在工业发酵中的优势，也为其他高附加值化合物的生物合成提供了新的技术路径。

综上所述，本研究通过多策略的综合应用，显著提升了长叶烯的产量，达到了目前的最高水平。这一进展不仅推动了长叶烯的生物合成研究，也为其他萜类化合物的高效生产提供了重要的理论和技术支持。未来，随着基因编辑技术和发酵工艺的进一步优化，长叶烯的工业化生产有望实现更大的突破，为可持续发展和绿色制造提供新的解决方案。