工程化ω-转氨酶，用于高效催化从甲醇开始的丝氨酸醇生物合成过程中的二羟基丙酮转氨反应

《Taiwanese Journal of Obstetrics and Gynecology》：Engineering ω-transaminase for efficient dihydroxyacetone transamination in serinol biosynthesis starting from methanol

甲醇到丝氨酸的模块化细胞-free酶级联反应研究

　　这一研究围绕一种创新的细胞外酶级联反应系统，即“甲醇到-serinol 路径”（MSP），旨在通过高效地将甲醇这种低成本的一碳（C1）原料转化为-serinol，为可持续生产提供新的思路。-serinol（2-氨基-1,3-丙二醇）作为一种重要的医药中间体，在多种药物和精细化学品中扮演着关键角色。传统化学或微生物合成方法在生产-serinol 时面临高能耗、产物毒性以及复杂的调控问题，因此开发一种绿色、高效的生物催化方法显得尤为重要。

研究人员通过构建一个包含两个模块的级联系统，成功实现了从甲醇到-serinol 的高效转化。模块1利用一种名为Mr-AOX的醇氧化酶和一种经过改造的formolase酶（FLS-M9）将甲醇转化为二羟基乙酰（DHA），而模块2则使用一种经过优化的ω-转氨酶（Cv-ωTA）进行直接的一步氨基化反应，从而生成-serinol。为了克服DHA氨基化反应中的速率限制问题，研究团队采用了“ALF扫描策略”，即通过系统性地改变关键位点的氨基酸，以提高酶的活性。经过筛选，他们发现一种三重突变体Cv-ωTA（Y153F/Y168F/C418F）的比活性比野生型提高了6.3倍，这不仅验证了结构指导的酶工程策略的有效性，也揭示了突变之间存在的非加性相互作用。

通过进一步的分析，研究团队发现这些突变之间存在显著的协同效应，特别是当Y153F、Y168F和C418F三个突变同时存在时，其活性提升远超预期。这表明在酶工程过程中，突变的顺序和组合对最终效果至关重要。此外，为了推动反应平衡向产物形成方向偏移，研究人员引入了一个丙酮酸去除与回收模块。这一模块包括乳酸脱氢酶（LDH）和丙酮酸脱氢酶（AlaDH），通过不断移除丙酮酸这一副产物，有效促进了-serinol的生成。实验结果表明，在优化条件下，整个级联系统可以在7小时内将150 mM甲醇转化为43.86 mM（即4 g/L）的-serinol，碳收率达到了87.7%，并且体积产率高达0.57 g/L/h。

这项研究的创新之处在于，它不仅解决了传统方法中对多碳底物的依赖，还突破了现有生物催化过程中因副产物积累而引起的反应平衡问题。此外，该系统具备模块化和可扩展性，为其他基于C1原料的化合物合成提供了通用策略。通过精确调控反应条件，如pH值、温度、氨基酸供体浓度等，研究人员进一步提升了整个级联反应的效率和稳定性。这些优化措施使得模块2能够在较低的氨基酸供体浓度下实现高效转化，从而降低了生产成本。

在实验设计方面，研究团队通过分子动力学模拟和伞形采样技术，深入分析了Cv-ωTA的结构变化及其对催化活性的影响。这些计算方法帮助他们揭示了突变如何通过改变活性位点的几何形状和化学环境，提高DHA的结合效率和反应活性。特别是，三重突变体Cv-ωTA（M3）的活性提升主要归因于其活性位点体积的收缩，以及对DHA与辅酶PMP之间关键距离的优化。这些结构变化不仅增强了酶的催化效率，还提高了其热稳定性，使其在工业条件下更具应用潜力。

研究团队还通过系统性筛选和优化，确定了模块1中最佳的酶浓度和反应条件。例如，通过调整Mr-AOX和FLS-M9的浓度，他们成功实现了从甲醇到DHA的高效转化，且DHA的产率接近理论最大值。这种高效的上游反应为后续的氨基化反应提供了充足的底物，从而保证了整个级联系统的顺利运行。

此外，该研究强调了绿色化学和可持续生物制造的重要性。甲醇作为一种可再生的一碳原料，其来源广泛且不与粮食供应竞争，因此在环境友好性方面具有明显优势。相比之下，传统方法多依赖于葡萄糖或甘油等多碳底物，这不仅增加了生产成本，还可能引发资源分配问题。通过将甲醇作为起始原料，这项研究为未来开发更多基于C1原料的绿色化学品合成路径提供了示范。

在实际应用方面，尽管该级联系统在实验室条件下表现出优异的性能，但其工业化应用仍面临一些挑战。例如，某些关键酶如FLS-M9在高负载条件下可能影响其稳定性和成本效益。因此，未来的研究方向可能包括利用机器学习和蛋白质语言模型等先进技术，进一步优化酶的性能，提高其在工业规模下的适用性。此外，将该级联系统集成到连续流动生物反应器中，进行放大实验，也是推动其应用的重要步骤。

这项研究不仅在技术层面实现了突破，还为生物制造领域提供了新的理论支持和实践路径。通过模块化设计和精准的酶工程策略，研究人员成功构建了一个高效、可持续的-serinol合成系统，为绿色化学和循环经济的发展提供了新的可能性。此外，该研究还展示了如何通过系统性的实验设计和计算方法，识别和优化关键酶的活性，从而推动整个生物合成过程的效率提升。这种综合性的方法不仅适用于-serinol的合成，也为其他一碳化合物的生产提供了可借鉴的框架。