从体外实验到体内实验的外推方法（QIVIVE）用于研究阿特拉津对磷酸二酯酶和芳香化酶mRNA表达的影响：首先在体外实验中观察这些效应，然后基于药代动力学原理将这些结果外推到大鼠体内的情况

《Toxicology in Vitro》：Quantitative in vitro to in vivo extrapolation (QIVIVE) of atrazine's effects on phosphodiesterase and aromatase mRNA expression in vitro to the rat in vivo based on pharmacokinetic

莠去津及其代谢物对磷脂二酯酶（PDE）活性和芳香化酶mRNA表达的影响研究。通过体外实验和体内药代动力学分析，发现高浓度莠去津体外抑制PDE并诱导芳香化酶mRNA表达，但体内代谢为DACT等活性较低的产物，导致体内效应不显著。应用QIVIVE方法计算显示，体外NOEC与体内AUC比值高达350-1013倍，表明体外数据无法直接外推至体内，需考虑代谢和药动学差异。

　　### 研究概述与背景

近年来，毒理学研究正在逐步减少对传统整动物生物测定的依赖，转而引入“新型方法学（NAMS）”来评估化学物质的安全性（Parish et al., 2020；Stucki et al., 2022；Magurany et al., 2023）。这些方法学包括定量从体外到体内的外推（QIVIVE）技术（Blaauboer, 2010；Yoon et al., 2012；Wilk-Zasadna et al., 2015；Louisse et al., 2017），旨在将体外实验结果与动物实验数据联系起来，从而为人类健康风险评估提供依据（Meek and Lipscomb, 2015；Lu et al., 2024）。这些方法的引入是为了提高评估的准确性，并更好地理解化学物质在生物体内的实际影响。

本研究聚焦于一种广泛用于控制阔叶植物和禾本科杂草的除草剂——阿特拉津（ATZ）及其氯代代谢产物对磷脂酶（PDE）活性和芳香化酶（aromatase）mRNA表达的影响。研究还通过QIVIVE方法计算了氯三嗪类化合物在人体中的暴露边际，以评估这些化合物的潜在风险。这一研究不仅有助于理解ATZ的毒性机制，还展示了如何将体外实验数据外推至整个生物体，包括人类，以进行更准确的风险评估。

### 实验方法

#### 实验1：阿特拉津及其氯代代谢产物对PDE酶活性的影响
在本实验中，研究人员使用了体外系统来评估ATZ及其代谢产物对PDE酶活性的影响。PDE是一种在多种生物体中广泛存在的酶，其活性变化可能与多种生理过程相关，包括细胞信号传导和激素合成。实验中，ATZ及其代谢产物（如二乙基阿特拉津（DEA）、二异丙基阿特拉津（DIA）和二氨基氯三嗪（DACT））被用于PDE抑制实验，使用了荧光标记的cAMP底物和IMAP PDE活性检测试剂盒。实验结果显示，ATZ对PDE的抑制作用显著，其IC50值为39.52 μM。相比之下，其代谢产物的抑制效果较弱，其中DACT、羟基阿特拉津和胺线（ammeline）几乎没有抑制作用。

此外，研究还评估了DACT对ATZ抑制PDE活性的修饰作用。在某些实验条件下，DACT的存在导致ATZ的IC50显著增加，表明DACT可能通过某种机制影响ATZ对PDE的抑制效果。这一发现对理解ATZ在体内的代谢行为及其对PDE的影响具有重要意义。

#### 实验2：阿特拉津及其代谢产物对芳香化酶mRNA表达的影响
在实验2中，研究人员评估了ATZ及其代谢产物对两种甾体生成细胞系（H295R和JEG-3）中芳香化酶mRNA表达的影响。H295R细胞来源于人类肾上腺皮质癌，而JEG-3细胞来源于人类胎盘绒毛膜癌。实验结果显示，ATZ在10 μM浓度下可使H295R细胞中芳香化酶mRNA表达增加2至3倍。JEG-3细胞也表现出类似的结果。然而，H295R和JEG-3细胞在体外条件下未能代谢ATZ，因此ATZ的暴露浓度在这些细胞中持续较高。

研究人员还评估了其他代谢产物（如DEA和DIA）对芳香化酶mRNA表达的影响。结果表明，DEA和DIA在10 μM浓度下对芳香化酶mRNA表达的影响远低于ATZ。此外，DACT、羟基阿特拉津和胺线对芳香化酶mRNA表达没有显著影响。这些数据表明，ATZ对芳香化酶的诱导作用主要来源于其本身，而非代谢产物。

#### 实验3：阿特拉津及其代谢产物在大鼠和人类肝细胞中的代谢与药代动力学
实验3研究了ATZ及其代谢产物在大鼠和人类肝细胞中的代谢行为及药代动力学特性。研究人员通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，发现ATZ在大鼠肝细胞中主要被N-脱烷基化为DEA和DIA，随后进一步代谢为DACT。相比之下，人类肝细胞对ATZ的代谢更倾向于生成DEA，而DACT在人类肝细胞中的浓度略高于大鼠肝细胞。药代动力学分析显示，ATZ在大鼠体内迅速被吸收并清除，其血浆浓度在给药后45分钟内下降至检测限以下。而DEA和DIA的血浆浓度在短时间内达到峰值，随后快速清除。DACT的血浆浓度则在给药后数小时才出现，并且清除速度较慢。

此外，研究人员还评估了不同给药方式（如灌胃和饮食）对ATZ及其代谢产物的药代动力学影响。结果表明，饮食给药方式导致ATZ在血浆中的浓度变化与昼夜节律相关，而灌胃给药则导致更快速的吸收和清除。这种差异对评估ATZ在不同暴露途径下的潜在风险具有重要意义。

#### 实验4：氯三嗪类化合物在大鼠中的药代动力学
实验4进一步研究了ATZ及其氯代代谢产物在大鼠体内的药代动力学特性。研究人员通过给药后不同时间点的血浆浓度测定，评估了这些化合物的吸收、分布、代谢和排泄情况。结果表明，ATZ在灌胃给药后迅速被吸收，其血浆浓度在45分钟内下降至检测限以下。相比之下，饮食给药导致ATZ的血浆浓度变化较慢，且与昼夜节律相关。DEA和DIA的血浆浓度在短时间内达到峰值，而DACT的血浆浓度则在较晚的时间点才出现，并且清除速度较慢。

药代动力学分析还表明，DACT在ATZ代谢过程中起着重要作用。DACT的血浆浓度在灌胃给药后达到峰值，并且在饮食给药后也显示出一定的积累。这些数据对于理解ATZ在体内的代谢路径及其对PDE和芳香化酶的影响具有重要意义。

### 实验结果

#### 实验1：PDE酶活性的体外抑制
实验1的结果显示，ATZ对PDE的抑制作用显著，其IC50值为39.52 μM。相比之下，其代谢产物（如DEA、DIA和DACT）的抑制效果较弱。DACT在某些实验条件下导致ATZ的IC50显著增加，表明DACT可能通过某种机制影响ATZ对PDE的抑制作用。这一发现对理解ATZ在体内的代谢行为及其对PDE的影响具有重要意义。

#### 实验2：芳香化酶mRNA表达的体外变化
实验2的结果显示，ATZ在10 μM浓度下可使H295R细胞中芳香化酶mRNA表达增加2至3倍。JEG-3细胞也表现出类似的结果。然而，H295R和JEG-3细胞在体外条件下未能代谢ATZ，因此ATZ的暴露浓度在这些细胞中持续较高。DEA和DIA在10 μM浓度下对芳香化酶mRNA表达的影响远低于ATZ。DACT、羟基阿特拉津和胺线对芳香化酶mRNA表达没有显著影响。这些数据表明，ATZ对芳香化酶的诱导作用主要来源于其本身，而非代谢产物。

#### 实验3：肝细胞中的代谢与药代动力学
实验3的结果显示，ATZ在大鼠和人类肝细胞中被迅速代谢为DEA和DIA，随后进一步代谢为DACT。药代动力学分析显示，ATZ在灌胃给药后迅速被吸收，其血浆浓度在45分钟内下降至检测限以下。而DEA和DIA的血浆浓度在短时间内达到峰值，随后快速清除。DACT的血浆浓度则在给药后数小时才出现，并且清除速度较慢。这些数据表明，ATZ在体内的代谢路径和清除速度对其对PDE和芳香化酶的影响具有重要影响。

#### 实验4：氯三嗪类化合物的药代动力学
实验4的结果显示，ATZ在灌胃给药后迅速被吸收，其血浆浓度在45分钟内下降至检测限以下。相比之下，饮食给药导致ATZ的血浆浓度变化较慢，且与昼夜节律相关。DEA和DIA的血浆浓度在短时间内达到峰值，而DACT的血浆浓度则在较晚的时间点才出现，并且清除速度较慢。这些数据表明，ATZ在体内的代谢路径和清除速度对其对PDE和芳香化酶的影响具有重要影响。

### 讨论

本研究的结果表明，ATZ在体外能够显著抑制PDE活性，并增加芳香化酶mRNA表达。然而，这些体外效应在体内并未观察到。这可能是由于ATZ在体内被迅速代谢为DEA、DIA和DACT，而这些代谢产物对PDE和芳香化酶的影响较小。此外，体内代谢可能显著降低了ATZ对PDE的抑制效果，从而使其在体内无法达到抑制PDE所需的浓度。

研究人员还发现，ATZ在体内被代谢为DEA、DIA和DACT，其中DACT是主要的代谢产物。DACT的血浆浓度在体内较高，且清除速度较慢。然而，DACT对PDE的抑制作用较弱，甚至可能具有拮抗作用。因此，ATZ在体内的代谢可能显著降低了其对PDE的抑制效果，从而使其在体内无法达到抑制PDE所需的浓度。

此外，本研究还评估了ATZ及其代谢产物在体内对芳香化酶mRNA表达的影响。结果表明，体内ATZ的暴露浓度远低于体外实验中观察到的NOEC（无效应浓度）。因此，ATZ在体内可能无法诱导芳香化酶的表达，从而不会对激素代谢产生显著影响。

研究人员还发现，体内代谢可能显著影响ATZ的药代动力学特性。例如，饮食给药导致ATZ的血浆浓度变化较慢，且与昼夜节律相关。而灌胃给药则导致更快速的吸收和清除。这些差异对评估ATZ在不同暴露途径下的潜在风险具有重要意义。

### 结论

本研究的结果表明，ATZ在体外能够显著抑制PDE活性，并增加芳香化酶mRNA表达。然而，这些体外效应在体内并未观察到，可能是由于ATZ在体内被迅速代谢为DEA、DIA和DACT，而这些代谢产物对PDE和芳香化酶的影响较小。此外，体内代谢可能显著降低了ATZ对PDE的抑制效果，从而使其在体内无法达到抑制PDE所需的浓度。

研究人员还发现，体内ATZ的暴露浓度远低于体外实验中观察到的NOEC，因此ATZ在体内可能无法诱导芳香化酶的表达。这些结果表明，ATZ的体外效应在体内可能并不显著，因此在进行风险评估时，需要考虑体内代谢对体外实验结果的影响。

此外，本研究还展示了QIVIVE方法的应用，该方法能够将体外实验结果外推至体内，从而为风险评估提供更准确的数据。通过计算体内与体外暴露的差异，研究人员得出ATZ在体内对PDE的抑制作用远低于体外实验中观察到的水平，因此在进行风险评估时，需要考虑体内代谢对体外实验结果的影响。

### 未来研究方向

尽管本研究提供了关于ATZ及其代谢产物对PDE和芳香化酶影响的重要信息，但仍有一些问题需要进一步研究。例如，ATZ在体内代谢后的具体作用机制尚未完全阐明。此外，不同暴露途径（如饮食、饮用水和职业暴露）对ATZ的影响可能存在差异，需要进一步评估。此外，体内代谢产物（如DACT）对其他生理过程的影响也需要进一步研究。

总的来说，本研究为理解ATZ的毒性机制和风险评估提供了重要的数据，并展示了QIVIVE方法的应用。未来的研究应进一步探索ATZ及其代谢产物对其他生理过程的影响，并评估不同暴露途径下的潜在风险。