对猪屠宰场中尸体及加工环境中的微生物组和抗性组的深入分析

《Veterinary Microbiology》：In-depth Characterization of Microbiome and Resistome of Carcasses and Processing Environments in a Swine Slaughterhouse

抗微生物耐药性（AMR）是全球健康重大挑战，本研究通过全基因组测序技术分析意大利某猪屠宰场污染区与清洁区及肉尸的微生物群和耐药基因分布。结果显示污染区携带更高水平的耐药基因（如甲氧西林类、磺胺类、四环素类）及耐药菌属（如Acinetobacter spp., Streptococcus suis, Aliarcobacter cryaerophilus），且质粒介导的基因水平转移（LGT）在污染区显著增强，提示屠宰场环境可能成为耐药基因传播热点。

　　抗菌素耐药性（AMR）是当今世界面临的重大挑战之一。在猪生产链中，各个阶段都被认为是抗菌素耐药基因（ARGs）的潜在储存库。本研究采用全基因组宏基因组测序技术，对猪屠宰场和猪胴体进行分析，以了解微生物群落及其相关的抗菌素耐药基因。结果显示，Actinomycetota和Pseudomonadota是所有样本中占主导地位的门类，而Bacillota、Bacteroidota和Campylobacteriota则在脏区和胴体样本中更为常见，而在清洁区中则较少见。关键的抗菌素耐药细菌包括Acinetobacter、Aeromonas和Streptococcus等属，其中Acinetobacter spp.、Streptococcus suis和Aliarcobacter cryaerophilus被识别为对食品安全具有高优先级的物种，因为它们具有持久性和与抗菌素耐药基因的关联。多个属类与大环内酯类、林可酰胺类和β-内酰胺类抗菌素的耐药性存在显著相关性。此外，质粒携带和横向基因转移（LGT）事件在脏区和胴体样本中相较于清洁区样本更为频繁，这表明抗菌素耐药基因可能在环境中传播，尤其是对大环内酯类和磺胺类抗菌素耐药基因的传播。四环素、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗菌素耐药基因是所有样本中最丰富的抗菌素耐药基因，这一发现与猪屠宰场的环境特征相符。本研究突显了猪屠宰场不同环境区域的微生物组特征差异，反映了细菌类群在特定加工条件下的适应性。研究结果对食品企业经营者具有重要意义，他们需要采取适当的卫生措施，以减少细菌食源性病原体的传播，并降低抗菌素耐药基因沿食物链转移的风险。

抗菌素耐药性（AMR）不仅是人类医学领域的重要问题，也是动物健康和环境管理中不可忽视的挑战。由于抗菌素耐药细菌（ARBs）和抗菌素耐药基因（ARGs）在人类、动物和环境的微生物群中循环传播，它们构成了“一个健康”（One Health）框架下的复杂问题。抗菌素耐药性的传播可以通过垂直转移或横向基因转移（LGT）事件发生，这些转移过程通常由可移动遗传元件（MGEs）如质粒、转座子和整合子所介导。这些遗传元件在微生物群体中发挥着关键作用，有助于抗菌素耐药基因的扩散，从而导致多重耐药细菌（MDR）的出现。抗菌素耐药性的产生和扩散主要受到人类和兽医医学中抗菌素使用、滥用和过度使用的影响。为应对这一问题，欧洲委员会在2006年禁止了抗菌素在动物饲料中的使用作为生长促进剂，同时抗菌素耐药性管理计划在全球范围内获得了重要地位。2023年，欧洲联盟理事会再次强调了对环境中抗菌素耐药性进行系统监测的迫切需求，特别是在水和农业食品生产系统中，这符合“一个健康”的整体策略。食品生产环境，尤其是在畜牧业的背景下，被认为是抗菌素耐药细菌在动物、人类和环境之间循环传播的热点区域。

近年来，多项研究已揭示猪生产链中各个阶段，包括农场环境、猪微生物群、猪粪便、污水和最终产品，都可能成为抗菌素耐药基因的储存库。这些研究不仅强调了抗菌素耐药基因的多样性，还突出了横向基因转移（LGT）事件在抗菌素耐药传播中的关键作用。意大利是欧洲最大的猪肉生产国之一，贡献了欧洲总产量的约6%，与德国、西班牙、荷兰、波兰、法国、丹麦和比利时等国共同占据重要市场份额。根据欧洲兽医抗菌素使用监测（ESVAC）的数据，意大利也是兽医抗菌素销售的主要国家之一，其中猪肉产业的抗菌素使用量是主要贡献因素，尽管近年来销售量有所下降。鉴于抗菌素的大量使用，意大利猪场中抗菌素耐药细菌（ARBs）和抗菌素耐药基因（ARGs）的循环传播风险较高。然而，关于意大利猪场中抗菌素耐药性的研究仍较为有限。

传统的抗菌素耐药性研究方法主要依赖于培养技术，这些方法在国家和国际实验室中被广泛使用。然而，这些方法通常集中在少数指示微生物、药物组合上，无法检测到非培养细菌及其抗生素耐药性决定因子。因此，使用非培养依赖方法如全基因组宏基因组测序（WMS），也称为霰弹宏基因组学，已成为补充传统抗菌素耐药性监测系统的重要手段。这种方法能够更准确和全面地评估抗菌素耐药性的风险。许多基于WMS的研究已经聚焦于猪肠道和猪场微生物群以及耐药基因组（resistome），但较少关注抗菌素耐药性在猪屠宰场中的传播。例如，Scicchitano等人（2024）利用宏基因组技术研究了意大利两条猪生产链中ARGs和多重耐药细菌的分布，揭示了抗菌素耐药性在生产各阶段的传播及其对环境的潜在影响。该研究识别出了一些赋予对关键重要抗菌素类别耐药性的ARGs，并强调了这些基因对动物健康和人类健康可能带来的风险，因为它们可以从共生菌转移到致病菌。

在相同背景下，Gaire等人（2024）从美国一家商业性屠宰场收集了样本，应用靶向富集宏基因组方法评估了耐药基因组和微生物群的动态变化，从猪到达屠宰场到加工后。他们的研究结果强调了在屠宰场内采取干预措施在减少ARGs丰度方面的有效性，同时也展示了屠宰场环境对最终胴体微生物群的持续影响。此外，Li等人（2022）利用霰弹宏基因组技术分析了中国猪肉生产链，发现屠宰场阶段在塑造耐药基因组方面起着关键作用，各阶段的ARGs丰度和多样性变化可能影响下游传播风险。这些研究填补了关于猪屠宰场中抗菌素耐药性传播的空白，也突显了进一步研究的必要性。

本研究应用全基因组宏基因组测序技术，对猪屠宰场和猪胴体进行分析，以深入了解微生物群落及其相关的抗菌素耐药基因。在2022年11月，从一家位于意大利北部、产能较高的猪屠宰场（每小时屠宰500头猪）中收集了20个混合样本，共进行了4次采样（每次采样5个混合样本）。样本采集使用了3M?环境刮拭采样器棒和10mL宽谱中性化剂（Neogen，美国密歇根州）。共采集了五类样本，包括脏区表面（DS）、脏区排水（DD）、清洁区表面（CS）、清洁区排水（CD）和胴体样本（CAR）。样本采集后，进行了预处理步骤，包括在层流罩中加入10mL无菌磷酸盐缓冲盐（PBS，Sigma-Aldrich，美国密苏里州），并加入5个拭子，随后在搅拌机中以175 rpm的速度搅拌2分钟。搅拌后，将10mL搅拌液转移到无菌15mL塑料管中，进行5000 g离心5分钟。离心后，弃去上清液，保留细胞沉淀。

在进行测序之前，进行了文库制备和短读测序。文库制备和测序工作由Novogene（英国）完成，使用了NGS DNA Library Prep Set（产品编号PT004）和Illumina NovaSeq 6000平台，采用150 PE测序。在数据处理阶段，使用了TrimGalore v 0.6.0进行原始读取的适配器去除和质量修剪，参数设置为--paired --nextera --stringency 5 --length 75 --quality 20 --max n 2 --trim-n。随后，使用Bowtie2 v2.3.4.3（Langmead等人，2019）去除宿主DNA，参数设置为--sensitive-local，过滤掉来自噬菌体phiX174（GCF 000819615）、人类GRCh38（GCF 000001405.39）和Sus scrofa（GCF 000003025）参考基因组的读取。所有分析均使用R版本4.2进行，包括tidyverse（2.0.0）、ggpubr（0.6.0）、qualpalr（0.4.4）、vegan（2.6-8）、zCompositional（1.5.0-4）、glmnet（4.1-8）、Rtsne（0.17）、psych（2.4.12）和taxizedb（0.3.1）等关键R包。微生物丰度基于contig覆盖和读取数量进行计算，并通过taxizedb的分类功能进行分类。

Shannon alpha多样性通过vegan包中的多样性函数进行计算。结果表明，脏区样本（DD和DS）的α多样性高于清洁区样本（CD和CS），而胴体样本（CAR）的多样性最低。在每个区域中，排水样本的微生物多样性高于表面样本。统计学上显著的差异（p < 0.05）出现在多个样本比较中，包括DD与CD/CS的比较、DS与CS的比较、CD与CS的比较，以及CS与CAR样本的比较。β多样性分析通过使用基于读取级别的方法进行，结果显示不同样本类别形成了不同的聚类，胴体和脏区样本显示出一定程度的相似性。

在ARGs分析中，总共识别出908个与26类抗菌素相关的ARGs，而在contig级别则检测到154个与14类抗菌素相关的ARGs。ARGs的数量在读取和contig级别均表现出一致的模式。在CAR样本中ARGs的数量最高，其次是脏区样本，其中表面样本的ARGs数量高于排水样本。清洁区样本的ARGs数量最低。某些基因，如aph(3’’)-lb、aph(6)-ld、mphE、sul1和tet(39)，分别与氨基糖苷类、大环内酯类、磺胺类和四环素类抗菌素的耐药性相关，并在多种样本类型中广泛分布于质粒区域，而其他基因则在质粒区域中分布较少。DS和DD样本中，质粒携带的ARGs频率显著高于CS和CD样本，这表明在脏区和排水样本中，横向基因转移（LGT）事件可能更为频繁，从而导致抗菌素耐药基因的传播。相比之下，CAR样本中质粒携带的ARGs数量最低，表明这些样本的抗菌素耐药基因可能主要通过其他途径传播。

在讨论部分，抗菌素耐药性（AMR）被认为是全球健康的重要挑战，而屠宰场作为抗菌素耐药细菌传播的关键枢纽，其作用不容忽视。在屠宰过程中，动物体内的微生物群落，包括皮肤、毛发、鼻孔、泌尿生殖器官、口腔区域以及肠道中的微生物，可能被传播到周围环境和食物链中。尽管已有研究揭示了猪生产链中各个阶段的微生物群和抗菌素耐药基因的分布，但这些研究主要集中在农场环境和猪微生物群，而对屠宰场环境中的传播机制了解有限。本研究通过分析意大利猪屠宰场中的微生物多样性变化，进一步揭示了不同环境区域中微生物群落的分布特征。这些变化不仅反映了细菌类群在屠宰场内的适应性，还为食品企业经营者提供了针对不同屠宰区域制定卫生策略的依据。

研究结果表明，意大利猪屠宰场中不同环境区域的微生物组特征存在显著差异，这可能与细菌类群在屠宰过程中的分布和适应性有关。Actinomycetota和Pseudomonadota是所有样本中最为丰富的门类，这一发现与先前研究一致（Campos Calero等人，2020；Shedleur-Bourguignon等人，2023）。其他门类如Bacillota、Bacteroidota和Campylobacteriota在脏区和胴体样本中更为常见，而在清洁区样本中则较少见。在ARBs的分类中，Pseudomonadota（Proteobacteria）在所有样本中占据主导地位，其中特定的科如Moraxellaceae、Enterobacteriaceae和Aeromonadaceae表现出较高的相关性。这些结果表明，猪屠宰场的环境对微生物群落的组成和抗菌素耐药性的传播具有重要影响。

此外，研究还发现，在不同样本类型中，质粒携带的ARGs数量存在显著差异。脏区和排水样本中，质粒携带的ARGs数量高于清洁区和表面样本，这表明在这些区域中，横向基因转移（LGT）事件可能更为频繁，从而促进抗菌素耐药基因的扩散。某些特定的ARGs，如与氨基糖苷类抗菌素耐药性相关的aph(3’’)-lb、与大环内酯类抗菌素耐药性相关的mphE、与磺胺类抗菌素耐药性相关的sul1以及与四环素类抗菌素耐药性相关的tet(39)，在多种样本类型中广泛分布于质粒区域，而其他ARGs则在质粒区域中分布较少。这表明，质粒在微生物群落中可能扮演着重要角色，作为抗菌素耐药基因扩散的载体。

研究结果还揭示了不同环境区域中ARGs的分布模式。在脏区和排水样本中，ARGs的丰度和多样性均高于清洁区和表面样本，而胴体样本中ARGs的丰度最低。这种分布模式可能与不同区域的微生物环境和加工条件有关。例如，脏区由于接触更多的动物体液和排泄物，可能成为抗菌素耐药基因的富集区域。清洁区则可能由于较为严格的卫生管理，导致ARGs的丰度较低。这些发现为理解抗菌素耐药性在猪屠宰场中的传播路径提供了重要依据，同时也为制定有效的卫生措施以减少抗菌素耐药基因的扩散提供了科学支持。

在结论部分，研究强调了不同环境区域中微生物组特征的变化，这反映了细菌类群在屠宰线上的分布差异。这些变化对于食品企业经营者具有重要意义，他们可以根据不同屠宰区域的特征，采取针对性的卫生策略。在这一背景下，Acinetobacter spp.、Streptococcus suis和Aliarcobacter cryaerophilus被识别为具有特别关注价值的微生物物种，因为它们与食品安全和人畜共患病（zoonotic）风险密切相关。这些物种的耐药性特征和传播潜力，可能对公共健康构成威胁，因此需要进一步研究和监控。此外，研究还指出，不同环境区域中ARGs的分布可能受到多种因素的影响，包括微生物环境、加工条件和卫生管理措施，这些因素共同作用，影响抗菌素耐药性的传播路径和程度。

总体而言，本研究通过宏基因组测序技术，揭示了猪屠宰场中不同环境区域的微生物组特征和抗菌素耐药基因的分布情况。研究结果不仅为理解抗菌素耐药性在食物链中的传播机制提供了新的视角，也为食品企业经营者制定有效的卫生措施提供了科学依据。这些措施可以针对不同环境区域，以减少抗菌素耐药细菌的传播和抗菌素耐药基因的扩散，从而降低食品安全风险和公共卫生威胁。此外，研究还强调了质粒和横向基因转移在抗菌素耐药性传播中的关键作用，表明这些遗传元件在微生物群落中可能扮演着重要角色，作为抗菌素耐药基因扩散的载体。因此，针对这些机制的研究和干预措施，对于控制抗菌素耐药性的传播具有重要意义。