机械活性压电水凝胶生物电子器件通过机械-电-生物能量转换调控胶质细胞促进神经再生

《Nature Communications》：Mechano-bioactive hydrogel bioelectronics for mechanical-electrical-bioenergetic conversion and glia-modulating neural regeneration

本研究针对神经损伤修复中机械信号转导机制不清的难题，开发了超声驱动的BaTiO3-胶原蛋白压电水凝胶生物电子器件。研究发现该器件通过激活星形胶质细胞PIEZO1和施万细胞PIEZO2通道介导钙内流，促进线粒体融合和ATP合成，形成高效能量网络，显著改善了大鼠、比格犬和恒河猴的中枢及周围神经损伤修复效果。该工作首次揭示了机械-电-生物能量转换的多级能量转导机制，为神经再生提供了新的治疗策略。

　　

当神经受到损伤时，修复过程往往困难重重，这不仅是因为神经元自身的再生能力有限，更因为我们对神经修复的复杂机制了解不足。近年来，科学家们逐渐认识到，胶质细胞——如中枢神经系统中的星形胶质细胞和周围神经系统中的施万细胞——在神经再生中扮演着关键角色。它们不仅能调节神经元的存活和轴突再生，还能重塑神经微环境。然而，动态机械信号如何影响胶质细胞的能量代谢和神经调节功能，其背后的机械转导机制和细胞内细胞器（如线粒体）的响应仍不清楚。

机械刺激在神经发育和再生过程中调控着广泛的细胞活动。例如，在神经发生过程中，生长锥的机械张力推动轴突生长。外部机械刺激（如超声波和电信号）可以调节神经细胞活性和细胞器功能。这表明机械信号是神经调节的关键贡献者。机械转导涉及检测机械刺激并将其转化为细胞和亚细胞水平的生化信号。细胞通过受体-配体相互作用、细胞表面耦合和机械门控离子通道等机制感知机械信号。在质膜上的机械传感器实现机械信号的快速转导，带来膜电位的即时变化和随后的细胞内生化反应。在这些机械传感器中，PIEZO通道（PIEZO1和PIEZO2）成为多种生物过程（如感觉感知和器官发育）中机械应力的关键介质。这些PIEZO通道在神经发育过程中的胶质细胞中显著激活和表达。然而，它们在胶质细胞介导的神经再生中的作用尚未得到充分探索。

通常，对细胞施加机械刺激可以通过三种方式实现：（i）施加外部信号，如电或声波刺激；（ii）改变基质机械特性（如基质刚度）以影响细胞相互作用；（iii）施加机械力，如剪切流。机械活性植入物，如压电材料，因其能够转导外部机械信号用于组织再生而受到关注。将压电纳米材料生物电子器件与先进的组织工程技术相结合，为胶质细胞神经调节的机械生物学研究提供了有前景的平台。虽然这些材料在神经修复方面显示出潜力，但其作用机制尚不清楚，可能不仅仅涉及离子流的增加。对于压电神经修复中钙内流对细胞内信号转导和细胞器功能（包括线粒体）的影响，仍然缺乏充分的理解。

在这项发表于《Nature Communications》的研究中，研究人员开发了机械活性的BaTiO₃水凝胶生物电子器件，用于研究创伤性中枢和周围神经损伤中的胶质细胞机械转导和细胞内细胞器响应。他们利用超声波驱动压电材料产生压电势和局部微电流。这种超声驱动的压电生物电子器件将外部机械刺激转化为电信号，上调了星形胶质细胞中的PIEZO1通道和施万细胞中的PIEZO2通道。这种机械-电转导过程增加了胶质细胞的钙内流，随后激活线粒体功能并促进ATP合成。此外，研究还在多种动物模型（小鼠、大鼠、比格犬和恒河猴）中验证了压电生物电子器件的功效，以评估其在神经修复方面的广泛适应性和临床转化潜力。这项研究揭示了一种由机械活性压电生物电子器件支持的、通过胶质细胞线粒体动力学促进神经再生的新策略。

为开展研究，研究人员主要应用了以下关键技术方法：采用溶剂热法合成四方相BaTiO₃纳米颗粒并进行材料表征（包括SEM、TEM、XRD、拉曼光谱、压电力显微镜等）；通过COMSOL Multiphysics软件模拟超声波作用下BaTiO₃纳米颗粒的压电特性；构建可注射的BaTiO₃@COL-1压电水凝胶生物电子器件并进行流变学表征；使用大鼠原代施万细胞和星形胶质细胞进行三维压电水凝胶培养，并施加低强度超声波刺激（0.5 W/cm2，每天5分钟）；应用CRISPR/Cas9技术构建PIEZO1和PIEZO2敲除的胶质细胞系；利用qRT-PCR、Western blot、免疫荧光、钙离子荧光成像（Fluo-4 AM）、ATP检测、流式细胞术、RNA测序和生物信息学分析（如KEGG通路分析）探究分子机制；建立大鼠和恒河猴的坐骨神经挤压损伤模型、以及大鼠和比格犬的脊髓损伤模型，进行体内植入治疗和功能评估（包括组织学分析、电生理检测、透射电镜、行为学测试等）。动物实验均经相关机构伦理委员会批准。

Properties of ultrasound-driven piezoelectric hydrogel bioelectronics

研究人员首先合成了BaTiO₃纳米颗粒，并证实其具有均匀的尺寸（平均直径约90.53 nm）和四方相晶体结构，这是其压电行为的关键。压电力显微镜（PFM）和COMSOL模拟验证了该纳米颗粒在超声波刺激下能产生有效的压电响应。随后，他们将BaTiO₃纳米颗粒与胶原蛋白I（COL-1）混合，制备出可注射的压电水凝胶生物电子器件（BaTiO₃@COL-1）。流变学测试表明该水凝胶具有良好的机械性能。电学测试显示，加入BaTiO₃后水凝胶电阻显著降低，且在超声波刺激下产生的微电流比非压电水凝胶高出近一倍。细胞相容性实验确定了0.1 mg/mL为BaTiO₃的最佳使用浓度。

PIEZO2 mediated mechanotransduction for Schwann cell neuromodulation

研究发现，超声驱动的压电水凝胶生物电子器件（Piezo+US）能显著上调施万细胞中PIEZO2通道（而非PIEZO1）的表达，并激活多种电压门控钙通道（VGCCs），导致明显的钙内流。这进一步上调了钙调蛋白（Calmodulin）和cAMP的水平，并激活了JNK信号。同时，神经滋养因子BDNF、GDNF和施万细胞标志物S100β的表达也同步增加。重要的是，Piezo+US处理促进了线粒体网络的形成（TOM-20和MitoLite标记增加）、ATP合成增强，并上调了与葡萄糖摄取（GLUT1）、谷氨酰胺合成（Glutamine Synthetase）和ATP生产（ATP synthase subunit beta）相关的蛋白。线粒体动力学分析显示，融合蛋白（OPA1, MFN1, MFN2）表达上调，而裂变相关蛋白（pDrp1, MFF）表达下降，表明线粒体融合活动增强。通过PIEZO2基因敲除和VGCCs抑制剂（维拉帕米）的实验证实，PIEZO2是介导钙内流和后续线粒体激活、能量代谢及修复表型转换的主要通道，而VGCCs起辅助作用。RNA测序和KEGG分析进一步表明，差异表达基因富集在细胞外基质感应与重塑、钙信号通路和氨基酸代谢等通路。

PIEZO1 mediated mechanotransduction for repairing phenotype of astrocytes

与施万细胞不同，超声驱动的压电水凝胶生物电子器件主要上调星形胶质细胞中的PIEZO1通道。该处理促进了反应性星形胶质细胞（RAs）相关基因（如axin2, mmp13, mmp2）的表达，同时抑制了瘢痕形成星形胶质细胞（SAs）相关基因的表达，表明其诱导了有利于修复的星形胶质细胞表型。此外，神经支持功能相关基因（Ngf, Pdgf, GLP-1R, Slc2a1）和突触相关基因（Thbs2）的表达也显著上调。与施万细胞类似，Piezo+US处理也引发了星形胶质细胞的钙内流，并激活了cAMP-CREB信号通路。线粒体功能分析同样显示了线粒体网络增强、ATP合成增加以及MFN/OPA1介导的线粒体融合。星形胶质细胞的条件培养基显著促进了血管形成。RNA测序结果显示，差异表达基因涉及细胞结构、细胞骨架动力学、信号转导和神经调节等功能，KEGG分析提示与机械转导相关的信号通路发生了改变。

PIEZO-calcium-CREB signaling functioned in glial neuromodulation and energy metabolism

研究发现，PIEZO1/2是主要的机械传感器，介导钙内流。超声驱动的机械活性水凝胶生物电子器件处理上调了施万细胞和星形胶质细胞中的cAMP和钙调蛋白。对两种细胞的KEGG富集分析均揭示了cAMP和钙信号通路的富集，强调了钙信号在压电材料介导的胶质细胞激活中的关键作用。JASPAR数据库预测显示，转录因子CREB1（cAMP-responsive element-binding protein 1）很可能与PIEZO1/2基因的启动子区域结合。使用抑制剂（维拉帕米抑制钙内流，KG501抑制CREB）的实验证实，钙-CREB信号轴在胶质细胞激活中起着核心作用，它调控着PIEZO1/2的表达、钙内流、线粒体融合以及神经滋养因子（如GDNF, NGF）的分泌。

Schwann cell responsive mechanical neuroengineering for peripheral nerve generation

在大鼠和恒河猴的坐骨神经挤压损伤模型中，植入压电水凝胶生物电子器件并施加超声波刺激（Piezo+US）显著促进了神经再生。组织学分析显示，损伤部位PIEZO2阳性区域增加，神经纤维结构更清晰有序，胶原沉积更致密且取向更好，施万细胞（S100β标记）激活，血管生成（CD34标记）活跃。电生理检测表明，Piezo+US组大鼠的神经传导速度（NCV）和复合肌肉动作电位（CMAP）显著改善。透射电镜和甲苯胺蓝染色显示，Piezo+US组的髓鞘最厚，轴突直径最大。行为学测试（热板实验、悬尾实验、跑步机实验）表明，Piezo+US治疗组大鼠的感觉恢复、运动功能和情绪状态均优于其他组。在恒河猴模型中，即使未施加额外超声波（仅Piezo+HG），由于猴子自身肌肉活动产生的机械刺激，也观察到了类似的PIEZO2表达上调、神经再生改善、靶器官（肌肉、皮肤）再支配增强以及电生理功能恢复的效果。血液学、生化分析和主要器官组织学检查证实了该压电水凝胶生物电子器件在啮齿类和灵长类动物中具有良好的生物相容性。

Astrocyte-active mechanical neuroengineering for spinal cord repair

在大鼠和比格犬的脊髓损伤（SCI）模型中，植入压电水凝胶生物电子器件并施加超声波刺激（Piezo+US）有效促进了脊髓修复。组织学分析显示，损伤区域PIEZO1表达上调。膜片钳技术记录背根神经节（DRG）神经元活动表明，Piezo+US组细胞静息电位更正常，钙离子电流密度最高。免疫荧光分析显示，Piezo+US处理减少了瘢痕形成星形胶质细胞（Sox9阳性）的比例，增加了反应性星形胶质细胞（Nestin阳性），并降低了抑制轴突再生的软骨素硫酸蛋白聚糖（CSPG）的表达。同时，神经元存活（NeuN标记）、轴突生长（GAP43标记）、5-羟色胺能神经元活动（TPH2标记）以及血管生成（CD34标记）均得到促进。谷氨酰胺合成酶在损伤核心周围被激活。脊髓损伤导致的下肢肌肉萎缩也得到缓解。行为学测试（热板实验、BBB评分、开放旷场实验、跑步机实验）表明，Piezo+US组大鼠的感觉、运动功能和情绪状态恢复最佳。在比格犬脊髓半切模型中，Piezo+US治疗显著改善了后肢肌力、运动控制能力（Olby评分），并维持了术后体重。MRI扫描显示，Piezo+US组比格犬的脊髓连续性得到恢复。主要器官H&E染色未发现明显异常，证明了生物安全性。此外，在PIEZO2条件性敲除杂合子（PIEZO2eKO+/-）SCI小鼠模型中的初步实验表明，PIEZO2敲低也削弱了超声驱动压电水凝胶生物电子器件的修复效果，提示PIEZO通道在SCI机械神经工程中具有潜在作用。

Discussion

本研究开发了机械活性压电水凝胶生物电子器件，实现了机械-电-生物能量的转换，用于耗能巨大的神经修复。研究表明，超声驱动的压电生物电子器件将机械刺激转化为电信号，主要通过星形胶质细胞的PIEZO1和施万细胞的PIEZO2通道介导钙内流。这种机械-电转换激活了细胞内信号通路，促进了MFN和OPA1介导的线粒体融合，使其成为中心的生物能量枢纽，从而增强ATP生产，形成高效的能量网络以支持胶质细胞介导的神经修复。研究强调了PIEZO-钙-CREB信号轴在这一过程中的核心作用。虽然PIEZO1/2是主要的机械传感器，但VGCCs也被激活并微调钙动力学，不过其作用次于PIEZO通道。该策略的成功在于，超声波激活压电材料产生的电刺激，比单纯的超声波能更有效地激活PIEZO通道和下游信号。胶质细胞（星形胶质细胞和施万细胞）是代谢需求高的细胞，在神经损伤修复中为神经元提供结构和能量支持。线粒体作为细胞能量生产的关键细胞器，对物理力和机械转导做出结构和功能上的响应。本研究揭示的机械-电-生物能量转换机制，成功地将外部机械能转化为支持神经再生的细胞内生物能量。通过在大动物（比格犬）和非人灵长类动物（恒河猴）模型中的验证，该研究凸显了机械活性水凝胶生物电子器件在中枢和周围神经系统神经再生中的适用性和生物安全性，具有显著的临床转化潜力。研究的局限性在于未能精确鉴定对PIEZO激活最敏感的胶质细胞亚群，以及无法在体内无创地实时监测胶质细胞机械转导动力学。未来的研究方向包括利用单细胞RNA测序和谱系追踪技术明确应答细胞亚型，并探索线粒体生物能量学是否对PIEZO介导的机械敏感性存在反馈调节。

综上所述，这项研究阐明了机械活性压电水凝胶生物电子器件通过多级机械-电-生物能量转换促进神经再生的新机制，为开发先进的神经再生临床治疗模式奠定了坚实的基础。