单细胞激活筛选揭示Nr1i3和Nfix调控肝脏分区成熟的新机制

《Developmental Cell》：Single-cell activation screen identifies hepatic maturation regulators with zonal resolution

本研究针对体外诱导肝细胞成熟过程中代谢基因激活不全、胚胎基因沉默不足及缺乏分区特异性等难题，通过构建发育转录组图谱并结合单细胞CRISPR激活筛选，发现核受体Nr1i3（CAR）和转录因子Nfix可协同调控肝细胞向中央静脉周区域的特化成熟。该研究不仅揭示了肝脏分区化成熟的转录调控网络，更为体外功能性肝细胞定向分化提供了靶向策略。

　　

肝脏作为人体重要的代谢器官，其功能高度依赖于肝细胞的空间分区化特性——中央静脉周区域主要负责药物代谢，而门静脉周区域则承担糖原合成等功能。然而，在体外定向分化获得的功能性肝细胞样细胞（HLCs）往往存在代谢功能不全、胚胎基因持续表达以及缺乏分区特征等问题，严重限制了其在疾病建模和再生医学中的应用。

为了破解这一难题，德国马克斯·普朗克分子遗传学研究所的Atsuhiro Taguchi等研究人员在《Developmental Cell》上发表了最新研究成果。他们通过构建高分辨率的小鼠肝细胞发育转录组图谱，结合单细胞CRISPR激活筛选技术，系统鉴定了调控肝细胞晚期成熟的关键转录因子，并揭示了其在肝脏分区化形成中的核心作用。

研究人员首先建立了跨发育时间点（E11.5、E15.5、P1、P10、P30和8周成年）的肝细胞纯化策略，通过转录组分析发现药物代谢相关基因（如Cyp家族成员）的表达在出生后持续激活，而胚胎标志物（如Afp）的表达则逐渐沉默。基于这一发育动态特征，他们筛选出61个在发育晚期特异性表达的转录调控因子进行功能验证。

研究团队创新性地将dCas9激活系统（SAM）与单细胞RNA测序技术相结合，建立了高通量功能筛选平台。通过对E15.5胚胎肝细胞进行并行扰动筛选，发现核受体Nr1i3（CAR）能够强力诱导中央静脉周代谢基因的表达，而转录因子Nfix则有效抑制胚胎基因程序。进一步的空间转录组分析显示，肝细胞成熟不仅涉及分区特异性基因的激活，还需要抑制对侧分区基因的表达程序。

在机制层面，CUT&RUN染色质分析证实Nfix可直接结合中央静脉周基因（如Cyp2e1）和门静脉周基因（如Cyp2f2）的调控元件，表明其通过双向调控机制塑造肝细胞的分区特性。功能实验表明，Nr1i3和Nfix的协同激活，结合针对中央静脉周微环境的信号因子（包括地塞米松、MEK抑制剂、TGF-β抑制剂、视黄酸、Wnt激动剂和Notch抑制剂），可显著提升肝细胞的药物代谢酶活性和分区特异性功能。

本研究的主要技术方法包括：通过四倍体互补技术获得胚胎肝细胞；建立单细胞CRISPR激活筛选平台；利用流式细胞术进行肝细胞分区纯化；采用CUT&RUN技术分析转录因子结合特性；通过酶活性测定评估肝细胞功能成熟度。

研究结果一：发育转录组图谱揭示肝细胞成熟的关键时间窗口

通过阶段特异性表面标志物组合纯化肝细胞，研究人员发现肝细胞转录组在E15.5后发生显著转变，药物代谢相关基因在出生后持续激活，而胚胎基因在P30才完全沉默。这一发现为界定肝细胞成熟状态提供了准确的时间标志。

研究结果二：单细胞激活筛选鉴定Nr1i3和Nfix的关键调控作用

利用建立的筛选平台，研究人员发现Nr1i3激活可诱导包括Cyp家族、谷胱甘肽S-转移酶（GST）家族在内的245个代谢相关基因的表达，而Nfix则有效抑制Afp等胚胎基因。scMAGeCK分析进一步证实了这些调控关系的特异性。

研究结果三：微环境信号与转录因子协同促进分区成熟

研究人员发现，在Nr1i3和Nfix双重激活的基础上，添加针对中央静脉周区域的信号因子可进一步促进分区特异性基因表达，抑制门静脉周特征，使肝细胞代谢功能接近成年水平。

研究结果四：Nfix直接调控分区特异性基因的表达

CUT&RUN分析显示，Nfix在成年肝细胞中特异性结合中央静脉周基因的启动子区域，直接参与肝细胞成熟过程中的基因表达调控网络重塑。

该研究首次系统揭示了Nr1i3和Nfix在肝细胞分区化成熟中的核心作用，建立了转录因子与微环境信号协同调控细胞功能成熟的新范式。这些发现不仅深化了对肝脏发育机制的理解，更为体外生成功能成熟的肝细胞提供了重要理论依据和技术策略，对肝脏疾病建模、药物筛选和再生医学具有重要推动作用。