使用酶法合成的同位素标记内标，通过LC-MS/MS技术对基因组DNA中的6-甲基硫代-2′-脱氧鸟苷和6-硫代-2′-脱氧鸟苷进行定量分析

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：LC-MS/MS quantification of 6-methylthio-2′-deoxyguanosine and 6-thio-2′-deoxyguanosine in genomic DNA with enzymatically synthesized isotope-labelled internal standards

本研究建立LC-MS/MS方法用于定量基因组DNA中的6-硫代-2'-脱氧鸟苷（dTG）及其甲基代谢物6-甲基硫代-2'-脱氧鸟苷（dMeTG），并通过Jurkat细胞和患者样本验证该方法的有效性，为探讨硫嘌呤类药物抗白血病机制及突变效应提供工具。

　　

摘要

硫嘌呤类药物6-巯嘌呤（6-mercaptopurine）和6-硫鸟嘌呤（6-thioguanine，简称TG）是鸟嘌呤的类似物，用于治疗血液系统恶性肿瘤和免疫介导的炎症性疾病。其作用机制包括TG与天然鸟嘌呤竞争性地掺入DNA（形成DNA-TG）。DNA-TG可发生S⁶-甲基化（DNA-MeTG），而O⁶-甲基鸟嘌呤甲基转移酶能够去除O⁶-烷基鸟嘌呤上的烷基，但对DNA-MeTG的去除效果较差，这会导致DNA中S⁶-MeTG与T碱基之间的错配。如果这种错配未被复制后错配修复系统（MMR）识别，可能会导致突变负荷增加并形成新的表位，从而可能增加肿瘤细胞被免疫系统识别的概率。DNA-MeTG在硫嘌呤类药物抗白血病作用中的确切机制仍有待阐明。本文介绍了一种基于液相色谱-质谱联用技术（LC-MS/MS）的方法，用于定量基因组DNA中的6-硫代-2′-脱氧鸟苷（6-thio-2′-deoxyguanosine，简称dTG）及其甲基化代谢物6-甲基硫代-2′-脱氧鸟苷（6-methylthio-2′-deoxyguanosine，简称dMeTG），该方法使用了酶法合成的同位素标记内标6-硫代-2′-脱氧鸟苷-¹³C₂¹⁵N和6-甲基硫代-2′-脱氧鸟苷-D₃。纯化的DNA经过酶消化后转化为核苷，随后通过LC-MS/MS技术定量dMeTG和dTG，并将其含量相对于DNA中的2′-脱氧鸟苷含量进行标准化。该方法在经TG处理的Jurkat细胞中的适用性得到了验证，即使在DNA含量低于2 μg的样本中也能成功检测到dMeTG和dTG。此外，该方法也在患者样本中检测到了dMeTG，尽管其含量较低，主要出现在DNA-TG水平较高的样本中。所开发的dMeTG和dTG定量方法可用于进一步研究DNA-MeTG在硫嘌呤类药物作用机制中的作用，包括其抗白血病效果以及对获得性突变的影响。