钌(II)-乙酰唑胺结合物对碳酸酐酶的强效抑制作用：该作用与体外抗增殖活性无关

《Chemico-Biological Interactions》：Potent Carbonic Anhydrase Inhibition by Ruthenium(II)-Acetazolamide Conjugates Uncoupled from Antiproliferative Activity In Vitro

新型钒?配合物的合成及其碳ic anhydrase抑制和抗肿瘤活性研究。通过热反应合成并表征了两种钒?(II)tris-(pyrazolyl)methane配合物，评估其水溶性、分配系数及对CA isoforms I, II, IX, XII的抑制活性，显示在缺氧条件下对乳腺癌细胞具有中等抑制效果（IC50分别为143.3和40.9 μM）。

　　这项研究探讨了新型钌(II)配合物的合成及其在抑制人类碳酸酐酶（CA）和抗癌活性方面的潜力。研究人员合成了一种含三（吡唑基）甲烷（tpm）配体的钌(II)配合物，结合了乙酰唑胺（AcmH?）作为配体，这为开发新的抗癌药物提供了可能的候选分子。研究还涉及了对这些配合物的结构和理化性质的分析，以及其在生理类似条件下的行为。

碳酐酶是一类广泛存在于生物体内的酶，它们能够催化二氧化碳（CO?）与水的反应生成碳酸氢盐。这种酶的抑制在临床中被用于开发多种抗青光眼和利尿药物。此外，某些CA同工酶，如膜结合型IX和XII，与pH调节和肿瘤进展密切相关，因此成为抗癌治疗的重要靶点。传统的CA抑制剂主要包括磺胺类化合物和磺胺酸类化合物，这些药物在临床上被广泛应用。然而，研究者们发现将有机药物与金属配合物结合，可能通过协同作用增强其生物效应。这为探索新型CA抑制剂提供了思路。

钌(II)配合物因其较低的毒性、多样的配位化学特性以及在药物化学中的广泛应用而受到关注。乙酰唑胺作为一种已知的CA抑制剂，其五元杂环结构使其特别适合与金属中心配位。该化合物被广泛用于治疗多种疾病，包括青光眼、癫痫、高山病、周期性麻痹、颅内压升高、尿液碱化和心力衰竭。此外，乙酰唑胺已被证实可以抑制肿瘤的生长，这种效果在与其他抗癌药物联合使用时更为显著。

在该研究中，研究者们首次合成了含tpm配体的钌(II)乙酰唑胺配合物，并对一系列钌配合物的CA抑制活性和抗癌活性进行了比较评估。研究中涉及的配合物包括：[RuCl(κ3N-tpm)(PPh?)(κ1N-AcmH?)]Cl（5）、[Ru(κ3N-tpm)(PPh?)(κ2N,N’-AcmH)]NO?（6）、以及之前报道的钌(II)芳烃乙酰唑胺配合物。这些配合物通过热反应从[RuCl(κ3N-tpm)(PPh?)?]Cl（4）出发合成，分别在四氢呋喃（THF）和乙醇中进行反应，产率分别为46-57%。所有配合物均通过单晶X射线衍射、红外光谱（IR）和核磁共振光谱（NMR）进行了全面表征。

为了评估这些配合物在生理条件下的行为，研究者们进行了溶解度测试、辛醇/水分配系数（Log P??) 和在模拟生理溶液中的物种分析。这些测试不仅提供了配合物在体液中的溶解性和分布情况，还揭示了其在细胞环境中的稳定性。此外，密度泛函理论（DFT）计算被用来深入理解配合物5的结构和热力学性质。

研究结果显示，配合物5和6在模拟生理溶液中表现出中等的脂溶性，并且在含有乙酰唑胺的配位方式下具有较高的稳定性。这些特性使得它们在细胞环境中具有更好的行为。配合物5和6对人源CA同工酶I、II、IX和XII表现出显著的抑制活性，其抑制常数（K?）值处于低至亚纳摩尔范围内。这一发现表明，这些配合物可能在抑制CA活性方面具有较高的潜力。

值得注意的是，在缺氧条件下，配合物5和6对人源三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231表现出中等的抗增殖活性，其半数抑制浓度（IC??）分别为143.3 μM和40.9 μM。相比之下，配合物2和3则在相同的条件下无活性（IC?? > 200 μM）。这一结果提示，CA IX和XII在缺氧的肿瘤微环境中可能被过度表达，而配合物5和6可能通过抑制这些酶的活性，增强其抗癌效果。

研究还提到，之前合成的钌(II)芳烃乙酰唑胺配合物1和2在水/二甲基亚砜（DMSO）/氯化钠溶液中表现出快速且完全的乙酰唑胺解离。而配合物3则表现出更高的稳定性，这与其良好的水溶性有关。因此，配合物3被选为生物评估的候选物。然而，尽管这些配合物表现出较强的CA抑制活性，它们在体外实验中对顺铂敏感和耐药的人卵巢癌细胞系（A2780和A2780cisR）以及非肿瘤性的人胚胎肾细胞（HEK-293）均无明显的细胞毒性。

此外，研究团队扩展了对钌(II)为基础的抗癌药物的研究，引入了tpm配体的配合物家族。这些配合物通过单磷配体取代从母体配合物[RuCl(κ3N-tpm)(PPh?)?]Cl（4）出发合成。一般而言，具有足够脂溶性（Log P?? > 1）和配位稳定性衍生物显示出较强的细胞毒性，其作用机制可能与破坏线粒体钙稳态有关。

配合物5和6的合成方法在实验中得到了优化，以确保其结构的正确性和纯度。X射线晶体学数据表明，配合物5和6的晶体结构具有一定的特征，这有助于理解其在生物体系中的行为。配合物5的晶体结构显示，其分子具有独特的配位模式，这可能与其高效的CA抑制活性有关。

为了进一步评估配合物5和6的CA抑制活性，研究者们采用了一种基于CO?水合的停流法（stopped-flow assay）。这种方法能够精确测量酶促反应的初始速率，从而确定配合物的抑制能力。实验中使用了酚红作为指示剂，其在557 nm处的吸光度被用来监测反应进程。配合物5和6在该实验中表现出显著的抑制活性，其效果在不同浓度下均得到了验证。

除了实验数据，研究还通过DFT计算对配合物的结构和热力学性质进行了深入分析。计算结果表明，配合物5在水溶液中的结构和稳定性与实验数据一致，这为其在生物体系中的行为提供了理论支持。此外，DFT计算还揭示了配合物在不同环境下的能量变化，这有助于预测其在体内的行为。

研究团队还对配合物的溶解度进行了评估，通过将选定的配合物悬浮在D?O溶液中，并加入甲基磺酸二甲酯（Me?SO?）作为内标物，利用1H NMR光谱进行分析。该方法能够准确测定配合物在水中的溶解度，从而评估其在生物体内的生物利用度。

研究中还涉及了对实验条件的详细描述，包括反应物和溶剂的来源、纯度以及实验操作的具体步骤。所有反应均在空气环境中进行，避免了惰性气氛的要求，这在一定程度上简化了实验操作并提高了产物的纯度。此外，实验中使用了多种分析技术，包括红外光谱（IR）、核磁共振光谱（NMR）和X射线晶体学，以确保配合物的结构和性质得到了全面表征。

为了验证实验结果的可靠性，研究者们还进行了多次重复实验，并采用了不同的检测方法。例如，在评估CA抑制活性时，不仅使用了停流法，还结合了其他实验手段，如光谱分析和生物活性测试。这些多方面的验证确保了研究结论的科学性和准确性。

研究团队还讨论了这些配合物在实际应用中的潜力。尽管配合物5和6在体外实验中表现出较强的CA抑制活性，但其在体内的抗癌效果仍需进一步验证。此外，研究还指出，这些配合物的脂溶性和稳定性可能影响其在生物体内的分布和作用机制。因此，未来的实验应着重于评估这些配合物在动物模型中的行为，以及其在人体中的潜在疗效。

综上所述，这项研究为开发新的CA抑制剂和抗癌药物提供了重要的实验数据和理论支持。配合物5和6在CA抑制和抗癌活性方面的表现，表明它们可能成为未来药物开发的有力候选。然而，进一步的研究仍需探索其在体内环境中的行为，以及如何优化其结构以提高抗癌效果。