基于孟德尔随机化和网络毒理学，揭示PM2.5引发的不同类型膀胱炎的毒性机制及潜在靶点

《Ecotoxicology and Environmental Safety》：Revealing the toxicity mechanisms and potential targets of PM 2.5-induced different types of cystitis based on Mendelian randomization and network toxicology

土壤根瘤菌通过调节植物代谢和土壤理化性质，可降低聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）的毒性，但对聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）的吸收促进作用使其加剧植物生长抑制。代谢组学显示植物通过核酸代谢、抗氧化途径及氨基酸代谢响应微塑料压力，其中PET胁迫下根瘤菌上调核酸代谢和抗逆基因表达，而PP和PS胁迫则抑制关键代谢通路。研究为微塑料污染的微生物修复提供理论依据。

　　土壤微塑料（MPs）污染问题日益严重，而土壤-植物系统中共生微生物可能影响微塑料的环境行为以及植物对微塑料胁迫的响应。本研究通过将常见的初级塑料产品破碎为微塑料，探讨了微塑料对生菜（*Lactuca sativa* L.）在有丛枝菌根真菌（AMF）存在时的毒性效应和迁移行为。研究结果表明，共生AMF通过增强核苷酸代谢和玉米素生物合成，降低了PET的吸收和毒性，导致PET吸收量减少了20.64%，同时生菜生物量增加了11.43%。相比之下，AMF促进了PP和PS的吸收，并抑制了抗坏血酸代谢和赖氨酸生物合成，从而导致生菜生长状况变差。AMF对植物在PET胁迫下的营养质量和健康状态的正向调节作用，表明AMF具有缓解微塑料对农田中生菜的毒性以及修复农业区微塑料相关污染的潜力。

塑料制品因其经济性、轻便性和耐用性被广泛应用于各种领域。据预测，到2040年，全球塑料的总产量和消费量将达到7.36亿吨，这将进一步加剧塑料废弃物带来的环境威胁。通过风化和光照，塑料制品逐渐分解为更小的微塑料和纳米塑料。微塑料已被广泛发现于水生、陆地和大气生态系统中，对自然生态系统造成负面影响。陆地系统是微塑料的重要储存库，例如在中国农田土壤中，微塑料的丰富度可达55,971个/kg，微塑料浓度范围为300–67,500 mg/kg。因此，微塑料的长期存在可能对土壤生物多样性和生态系统功能构成威胁。

植物作为陆地生态系统的重要组成部分，其生长受到土壤污染的不可避免影响。微塑料对土壤-植物系统的影响已被证实。研究表明，微塑料会积聚在植物气孔中，导致植物呼吸和光合作用减少。此外，微塑料还会阻碍根系对水分和营养的吸收，从而抑制作物生长。同时，微塑料可能干扰基因表达和信号传导，并抑制蛋白质的生物合成。不同类型的微塑料对植物的毒性效应存在差异，例如聚醚砜（PES）主要通过限制营养吸收对植物产生不利影响，而聚酰胺（PA）则阻碍水分吸收。此外，PES对环境的威胁比PA和高密度聚乙烯（HDPE）更大。微塑料还会改变土壤微生物群落的结构和功能多样性，而土壤微生物的存在也可能影响微塑料在土壤-植物系统中的行为。然而，目前关于这种相互作用机制的研究仍较为有限，尤其是在土壤-微塑料-微生物共存的条件下，植物对微塑料污染的响应机制尚不明确。

AMF作为土壤-植物系统中普遍存在的根际微生物，与超过80%的陆地植物根系形成共生关系。AMF通过改变宿主根系及其根际环境，影响污染物的吸收和植物的响应。例如，研究发现AMF能够通过形成共生结构直接改变植物根系，从而抑制铬（Cr）的吸收，降低其对植物的毒性。AMF还能通过改变土壤有机酸和酶活性来减轻多环芳烃（PAHs）对植物的毒性。在微塑料方面，AMF的影响同样显著。例如，先前的研究发现，AMF的存在会增加小尺寸（0.5 μm）聚苯乙烯（PS）在生菜组织中的吸收和毒性，而大尺寸（2 μm）PS的吸收和毒性则受到抑制。此外，AMF能够抑制聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）从根部向可食用地上部分的运输。另一方面，PP和PES的加入会促进AMF-植物根系的定殖，而PE则会削弱植物-AMF共生关系。

本研究旨在阐明微塑料在土壤-微生物-植物系统中的影响，以及通过代谢组学方法揭示植物对微塑料胁迫的响应机制。同时，还探讨了AMF作为生物修复策略在减少植物体内微塑料吸收方面的潜力。基于此，研究选择了用于矿泉水瓶的聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）、用于食品包装的聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）作为原材料，生成微塑料。这种选择确保了微塑料的类型和形态能够真实反映其在土壤-微生物-植物系统中的实际存在状态。生菜作为一种常见的叶菜类作物，被选为研究对象，而AMF则作为典型的土壤微生物，选择了*Funneliformis mosseae*和*Entrophospora etunicatum*的分离株。在温室盆栽实验中，重点研究了三个方面：1）不同类型的微塑料对土壤-植物系统的影响；2）在AMF存在的情况下，不同类型的微塑料在土壤-植物系统中的环境行为及其相关毒性；3）在AMF存在的情况下，植物对不同来源微塑料的代谢应激响应机制。

实验材料包括一种来自中国环境科学研究院梨园根际的黄土。采集时间为春季（4月），采集后通过2 mm筛网去除根系碎片和碎石，然后在121 ℃和103 kPa下进行高压灭菌处理。实验土壤的物理和化学性质包括pH值7.66、总有机碳11.03 g/kg、总氮1.35 g/kg、总磷1.74 g/kg和总钾12.36 g/kg。实验土壤在灭菌后用于后续研究。生菜种子经过1%次氯酸钠（NaClO）浸泡10分钟，随后用无菌水冲洗4-5次以去除残留的次氯酸钠。灭菌后的种子放置在涂有75%乙醇的培养皿的滤纸上，用适量无菌水湿润，并覆盖纱布。种子在大约2-3天内发芽，之后移栽到土壤中。每个花盆装有500 g土壤基质，并施加微塑料悬浮液以达到10 mg MP/kg土壤的环境相关浓度。

在实验初期，将AMF混合接种菌（*Funneliformis mosseae*和*Entrophospora etunicatum*，质量比为1:1）加入土壤中，深度为2 cm。随后种植生菜种子。实验在气候室中进行，温度设定为13/15 ℃（日/夜），光照强度为200-230 μmol/(m2·s)。每周使用P-减少的Hoagland营养液浇灌植物以确保其正常生长。实验中选用的PET矿泉水瓶和PP、PS食品包装盒作为微塑料的原材料，其具体制备过程参考了Duan等（2023）的方法，并进行了适当调整。制备好的微塑料使用扫描电子显微镜（SEM）进行形态观察，同时通过ImageJ软件测定其粒径。聚合物组成通过X射线光电子能谱（XPS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行分析。微塑料的比表面积和平均孔径则通过加速特定表面积和孔隙度测定系统以及N?吸附/脱附法（ASAP 2460；Micromeritics Instrument Corp.）进行测定。微塑料的粒径顺序为PP（12.2 μm）>PS（9.1 μm）>PET（8.6 μm）。所有微塑料均具有疏水表面（接触角>80°），其中疏水性顺序为PS>PET>PP。微塑料的ζ电位均为负值（PET (-17.1)>PS (-11.8)>PP (-18.0)）。XPS分析显示，PET表面含有氧含物（C=O/O-C=O），而PP和PS表面主要由C-C键构成，PP表面含有少量C=O/O-C=O基团，如图S1、S2和表S1所示。

在实验过程中，对土壤和植物的生理生化指标进行了测定。在植物生长60天后，收获植物并将其分为地上部和地下部，分别测定其鲜重和干重。干重测定通过在55 ℃下使用DHG-9036A型烘箱进行。光合速率和叶绿素含量在植物生长60天后测定，分别使用3051D型光合测定仪和TYS-B型叶绿素测定仪。AMF感染率通过乙酸墨水法测定。植物激素（生长素IAA、赤霉素GA和脱落酸ABA）通过商业试剂盒（ELISA试剂盒；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）进行测定。植物活性氧（ROS）、抗氧化剂（谷胱甘肽GSH）以及抗氧化酶（超氧化物歧化酶SOD、过氧化物酶POD、过氧化氢酶CAT和抗坏血酸过氧化物酶APX）的含量也进行了测定。在测定前，植物根系需要进行预处理，具体方法为：将0.1 g植物根系在液氮中冷冻1分钟，加入1.5 mL磷酸盐缓冲液（PBS）并置于冰上研磨。研磨后的悬液转移至5 mL离心管中，以3000 rpm离心20分钟，然后按照试剂盒说明进行测定。植物根系通过3,3'-二氨基苯甲酰（DAB）和硝基四氮唑蓝氯化物（NBT）进行染色，以评估氧化损伤。根系分泌物的收集按照Cai等（2024）的方法进行，具体步骤详见文本S2。根系分泌物中的有机酸和氨基酸通过液相色谱（LC Thermo 300；Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA）和自动氨基酸分析仪（LA 8080；Hitachi, Tokyo, Japan）进行测定。实验土壤和收获后土壤的pH值通过pH计（PHB-4；Lei Ci, China）进行测定。所有测定均在三个生物重复中进行以确保准确性。

在收获后，收集用于培养植物的根际土壤进行酶活性测定。使用Feyzi等（2020）的方法测定土壤脲酶（S-UR）活性。具体方法为：在烧杯中称取5 g土壤样品，加入1 mL甲苯，混合15分钟后加入10 mL 10%尿素和20 mL柠檬酸缓冲液（pH 6.7），在37 ℃下培养24小时。培养后的样品用37 ℃的蒸馏水稀释并充分搅拌。过滤后，将3 mL滤液置于50 mL容量瓶中，加入10 mL蒸馏水、4 mL 1.35 M硫酸钠和3 mL次氯酸钠，并在20分钟内完成测定以确定脲酶活性。土壤酸性磷酸酶（S-AP）活性则使用对硝基苯基磷酸（50 mM）缓冲液进行测定。土壤超氧化物歧化酶（S-SOD）活性按照试剂盒说明进行测定。

植物叶片的代谢组学分析在植物生长60天后进行。取50 mg生菜叶片放入2 mL离心管中，加入400 μL提取液（甲醇：水，体积比为4:1），并加入内标（0.02 mg/mL，L-2-氯苯丙氨酸）。样品在-10 ℃和50 Hz下使用冷冻组织研磨机（WONBIO-96C；Wonbio Biotechnology Co. Ltd., Shanghai, China）研磨6分钟。随后在5 ℃下超声提取30分钟，并在-20 ℃下静置30分钟。样品在高速冷冻离心机（Microcentrifuge 5430 R；Eppendorf, Hamburg, Germany）中以13,000 g离心15分钟，收集上清液用于超高效液相色谱-质谱联用（UPLC-MS，Exactive HF-X；Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA）分析。在测试前，将所有样品等体积混合以制备质量控制样品，这些样品在整个分析过程中被引入以确保方法的可重复性。

所有相关图中的误差条代表三个生物重复的标准差，展示了个体植物之间的变异情况。使用单因素方差分析（ANOVA）对生物重复数据（n=3）进行分析，以确定处理效应的显著性。使用SPSS 20.0软件进行最小显著差（LSD）检验，p<0.05表示均值显著。使用SPSS Amos Graphics（SPSS AMOS 26；IBM, USA）和PowerPoint（Microsoft Office 16）对结构方程模型进行评估和可视化。多变量统计分析使用MajorBio云平台和Bioconductor提供的ROPLS（版本4.3.4）R软件包进行，数据分析和可视化使用Origin 2022（OriginLab, Northampton, MA, USA）和R Studio完成。

研究结果表明，AMF改变了生菜对不同类型微塑料的吸收能力。在AMF存在的情况下，PET的吸收能力显著降低，导致PET在根部和叶片中的浓度分别从31.28和26.58 mg/kg降至24.82和23.50 mg/kg。然而，AMF改变了根际环境，使PP和PS在植物中的浓度显著增加。PP和PS在AMF处理组中的根部和叶片浓度分别达到非共生对照组的1.12和1.17倍，而PS的增强效果更为显著，达到1.33和1.34倍。此外，AMF还改变了土壤pH值，对PP和PS处理组的土壤pH值进行了升高，而对PET处理组的土壤pH值进行了降低。土壤pH值对微塑料在土壤中的迁移具有重要影响，较高的pH值增加了微塑料在土壤中的移动性，从而促进其进入植物根部。相反，较低的pH值会增加PET在土壤中的固定，抑制其被植物吸收。AMF引起的根系分泌物变化与上述土壤pH值的变化密切相关。AMF的引入导致PET处理组的根系分泌物中某些酸性物质的增加，如苏氨酸和谷氨酸分别增加了1.53倍和1.55倍。这些根系分泌物的增加提高了土壤的正电荷，从而增强了负电荷微塑料与土壤H?的结合，降低了微塑料在土壤中的移动性，进而防止其进入植物。此外，根系分泌物还能吸附微塑料，阻碍其被植物吸收。PP和PS处理组的根系分泌物减少，其中谷氨酸的减少最为显著，分别降至非AMF对照组的75.98%和68.02%。丙二酸的减少则较为轻微，分别降至72.84%和90.83%。通常情况下，AMF的引入会显著改变土壤pH值和根系分泌物，从而影响微塑料在土壤-植物系统中的迁移和富集。

植物激素与植物生长状态之间的紧密关系构成了缓解非生物胁迫的重要机制。例如，生长素IAA和赤霉素GA的增加可以增强植物抗氧化系统的活性，从而提高其对胁迫的抵抗力。此外，低浓度的脱落酸ABA可以刺激主根生长，有助于植物的胁迫适应。研究发现，AMF在PET胁迫下增加了植物激素的含量，特别是GA浓度增加到2332.21 ng/g，这表明AMF通过增加植物激素的含量来促进植物对PET的适应，从而提高其生长能力。然而，在PP和PS处理组中，植物激素的含量减少，表明AMF削弱了植物对PP和PS胁迫的耐受能力，增加了其毒性效应。通过结构方程模型和热图，可以更清晰地反映AMF存在时的关键影响因素。AMF在PET处理组中更有可能通过改善抗氧化系统和营养吸收来促进植物生长，而在PP处理组中，AMF通过改变土壤酶活性来影响植物生长，而在PS处理组中，AMF则通过影响植物激素来显著抑制植物生长。总体而言，AMF的接种在无微塑料胁迫的情况下能够促进植物最旺盛的生长，而在三种微塑料处理下，植物生长均受到抑制，其中PP的植物毒性最强，其次是PET，最后是PS。AMF对PET的缓解作用显著，但对PP和PS的毒害作用却更为明显，导致植物生长顺序为PET+AMF>PS+AMF>PP+AMF。

进一步研究发现，AMF改变了生菜叶片对不同类型微塑料的代谢响应。偏最小二乘判别分析（PLS-DA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）显示，PET和AMF-PET组之间存在显著分离，表明两组之间存在显著差异（图5和S11）。京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析显示，在微生物存在的情况下，植物的核苷酸代谢、精氨酸代谢、玉米素生物合成、半胱氨酸和甲硫氨酸代谢、嘌呤代谢以及氮代谢均显著改变（图5）。为了进一步理解不同代谢物与相关代谢途径以及植物对微塑料胁迫的响应之间的具体关系，绘制了代谢途径图，并标记了重要代谢物的变化（图5b和S11d）。关键代谢物水平的变化反映了代谢通量的重新编程，这种通路之间的资源再分配（例如从初生代谢向次生代谢转移）可以最终重塑植物的表型并增强其对胁迫的抵抗力。研究发现，AMF的引入增加了植物中的谷氨酰胺含量，而谷氨酰胺同时参与核苷酸代谢途径和植物细胞信号转导中的氨基酸形成，这有助于植物的生长和发育。此外，核苷酸途径参与植物激素的合成和分布，这与之前的研究结果一致，即AMF的引入显著增加了PET处理组生菜中的植物激素含量。腺嘌呤的上调促进了核苷酸和玉米素途径，从而通过增加细胞分裂协调整体植物生长，这可能是AMF促进PET处理组植物生长的最直接原因。半胱氨酸和甲硫氨酸代谢物（如谷胱甘肽）可以提高植物的抗氧化能力、解毒能力和对环境变化的适应能力，这与AMF改善PET处理组植物抗氧化系统活性的发现相一致。精氨酸和氮代谢不仅能够改善植物的营养吸收，还能缓解外部胁迫引起的营养障碍，这与AMF提高植物氮含量的发现相一致。植物代谢途径并非孤立运作，而是形成一个复杂的相互连接网络，支持正常的生理和生态过程。AMF通过调整多个代谢途径，增强植物激素、抗氧化系统活性和营养吸收能力，使植物在微塑料胁迫下正常生长和发育。

在PP处理组中，AMF对植物的影响更为显著。PLS-DA和OPLS-DA进一步显示，PP和AMF-PP组之间存在显著区别，表明两者之间存在显著差异（图6和S12）。此时，AMF对植物代谢途径的影响最为显著的是抗坏血酸代谢。结合关键代谢物，绘制了植物对PP的代谢响应途径（图6）。抗坏血酸是植物中重要的抗氧化剂，可以清除植物在环境胁迫下产生的过量活性氧（ROS）。此外，抗坏血酸还能保护光合器官并影响生长素的合成。本研究发现，AMF导致抗坏血酸的显著下调，这可能是AMF抑制PP处理组植物生长的主要机制。脯氨酸的下调则抑制了精氨酸和脯氨酸代谢途径的正常进展，不仅抑制了植物的氮吸收，还导致植物细胞中ROS的积累。因此，脯氨酸的下调不可避免地导致植物营养吸收的困难并增加氧化损伤，这与本研究的先前发现一致。因此，AMF通过调节脯氨酸，抑制了精氨酸和脯氨酸代谢途径的正常发展，从而加剧了PP处理组植物的损伤。

与PET和PP相比，AMF对PS处理组植物的影响较小。在PS处理组中，仅有11种代谢物和两条代谢途径发生显著变化（图7和S13）。根据代谢途径图（图7b），我们发现同型半胱氨酸既参与又调节了赖氨酸生物合成和丙酮酸代谢。丙酮酸作为“桥梁”，连接了糖代谢、脂代谢和蛋白质代谢等多个代谢途径，从而通过丙酮酸，植物可以调节各种代谢物的平衡以适应不同的胁迫和生长条件。赖氨酸是植物生命活动中的必需氨基酸，参与植物蛋白质合成和氮循环，其缺乏会导致植物生长迟滞和光合效率降低。在AMF存在的情况下，PS主要通过同型半胱氨酸的下调，抑制了赖氨酸生物合成和丙酮酸代谢，从而影响植物的光合作用和物质合成，最终导致植物生长下降并显著增加PS的毒性。本研究揭示了AMF在缓解特定微塑料毒性方面的潜力，表明AMF可能是一种用于土壤微塑料污染的绿色生物修复技术。目前大多数研究使用人工接种的特定微生物进行实验，未来研究应聚焦于筛选原生土壤中的优势微生物，以提供有效的理论支持，推动土壤微塑料的原位修复技术的发展。