酵母细胞壁的添加对海藻酸/乳清蛋白珠的黏附性、稳定性、口服渗透性以及胰岛素释放特性的影响

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Impact of yeast cell wall incorporation on the mucoadhesion, stability, oral permeability and release profile of alginate/whey protein beads loaded with insulin

本研究评估酵母细胞壁（YCW）对藻酸盐/乳清蛋白（ALG/WP）颗粒口服胰岛素递送效果的影响。通过体外、体外和体内实验发现，YCW增加了颗粒的粘度，减少了胰岛素涂层过程中的损失（封装效率65-99%），并抑制了胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶活性。然而，YCW未显著提高胰岛素的透皮渗透性或动物实验中的系统暴露量，可能因肠道环境稀释效应所致。

　　本研究旨在评估将酵母细胞壁（YCW）纳入海藻酸/乳清蛋白（ALG/WP）微粒中的策略对口服胰岛素输送的潜在影响。胰岛素载入微粒通过挤出-凝胶化工艺进行制备，分别采用含有或不含YCW的条件，随后对微粒的物理化学特性、黏附性和渗透性进行了体外、体内和体外实验评估。实验结果表明，YCW的加入显著增加了聚合物溶液的粘度，从而提高了微粒的凝聚性和胰岛素在包衣过程中的保留率。封装效率范围在65%到99%之间。然而，YCW并未显著影响微粒的尺寸或释放机制，这些仍以扩散控制为主。尽管YCW含有微粒表现出酶抑制和黏附性，但其对胰岛素的酶解保护效果与对照微粒相似。YCW在Caco-2细胞单层中适度增强了胰岛素的渗透性，且无细胞毒性，这与可逆的跨上皮电阻（TEER）降低一致。然而，这种效果并未转化为体外小肠或体内小肠给药后可测量的胰岛素吸收率的显著增加，表明YCW在生理复杂条件下作为吸收促进剂的贡献有限。

### 1. 引言

口服给药仍是药物递送的最常见和首选方式，因为其便捷性、安全性和高患者依从性。然而，许多治疗性肽和蛋白质，包括胰岛素，由于多种生理屏障导致口服生物利用度极低。这些屏障包括胃和小肠蛋白酶对胰岛素的酶解、酸性pH下的不稳定性以及水溶性大分子在小肠上皮中的渗透性限制。口服后，胰岛素在胃中迅速变性，并在胃肠道（GIT）中被蛋白酶如胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶降解，导致系统吸收率低于1%。因此，保护胰岛素免受降解和增强其跨上皮运输是实现成功口服输送的关键挑战。

为解决这些限制，已探索了多种载体系统，包括酶抑制剂、渗透性增强剂和基于黏附性聚合物的递送系统。理想的口服肽载体应满足以下条件：（i）确保高效的蛋白质负载和保护，（ii）维持封装药物的生物活性，（iii）在小肠吸收部位实现持续释放，（iv）由生物相容、食品级且无毒的材料组成。在天然生物聚合物中，酵母（Saccharomyces cerevisiae）及其细胞壁（YCW）因其安全性、可食用性和功能特性而受到越来越多的关注。YCW富含甘露蛋白、β-1,3-和β-1,6-葡聚糖以及少量几丁质，这些成分赋予其刚性、乳化能力和表面功能。基于酵母的系统在制药应用中显示出潜力：YCW可以作为包衣或封装剂，提供对严酷GIT条件的保护，并实现封装药物的受控释放。此外，酵母成分已被报道具有吸收增强作用。体外研究显示，酵母提取物或细胞壁组分可以暂时降低跨上皮电阻（TEER），从而以可逆且无毒的方式促进细胞间渗透性。这种机制涉及紧密连接蛋白（如ZO-1和occludin）从膜表面重新分布到细胞骨架，这可能由蛋白激酶C（PKC）激活介导。值得注意的是，这种效应归因于可溶性或纳米尺度的YCW组分，而非完整的酵母细胞，因为完整的酵母细胞太大，无法通过细胞间空间（通常为10-20纳米）。

### 2. 材料与方法

#### 2.1 化学试剂
乳清蛋白（WP）粉末由NZMP（新西兰，威灵顿）提供，其蛋白质含量为93%（干基），通过凯氏定氮法测定。海藻酸（ALG）由ISP（新泽西州，韦恩）提供，纯度为99%（干基）。酵母细胞壁（YCW）粉末由LeSaffre酵母公司（法国）提供。乙腈、甲醇、二水合氯化钙（CaCl?）、氢氧化钠（NaOH）、盐酸（HCl）、无水硫酸钠（Na?SO?）、磷酸（H?PO?）、胰蛋白酶（牛胰腺）、三氟乙酸（TFA）和人类胰岛素ELISA试剂盒由Fisher Scientific（法国，Illkirch）购买。商业人类胰岛素溶液（Umuline? Rapide，100 IU/mL）由Lilly France SAS提供。FITC标记的胰岛素（INS-FITC）和α-胰凝乳蛋白酶（牛胰腺）由Sigma-Aldrich（法国，圣昆汀法夫雷）提供。DMEM、胎牛血清、维生素、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺、抗生素溶液（青霉素103 IU/mL、链霉素10 mg/mL、两性霉素B 25 μg/mL）由Fisher Bioblock（法国，斯特拉斯堡）提供。

#### 2.2 药物溶液的制备
WP溶液（10.0和11.0% w/w）通过将WP粉末在去离子水中重新水合并在室温下进行温和的磁力搅拌1小时制备，随后静置2小时以确保蛋白质充分水合。溶液的pH值调整至7.0，使用氢氧化钠（NaOH）。接着，将溶液加热至80°C，持续40分钟以完全变性乳清蛋白。ALG溶液（1.5和3.0% w/w）在室温下通过磁力搅拌在去离子水中完全溶解。

#### 2.3 微粒制备与胰岛素负载
乳清蛋白/海藻酸复合微粒（WP/ALG MP，80/20 w/w）通过挤出-离子凝胶化工艺制备，如Hébrard等（2009）所述。简而言之，将WP/ALG混合物挤出成滴，然后将其放入0.1 M CaCl?凝胶浴中进行凝胶化。凝胶化后，将微粒通过过滤收集，冷冻至-80°C，并进行冻干处理。冻干在实验室冻干机中进行48小时，微粒置于压力<3 Pa的腔室中，保持-34°C 1小时，随后逐渐加热至10°C 24小时，最后在25°C下保持24小时。未负载的冻干微粒通过吸收/吸附方式加载胰岛素。将干燥的微粒浸入胰岛素溶液或INS-FITC溶液（用于显微镜观察）中5分钟，随后取出并轻轻擦拭。这些配方被称为INS-MP（胰岛素负载微粒）。加载后，微粒通过浸入纯ALG溶液（1.5% w/w）或纯WP溶液（10.0% w/w）进行包衣，然后在0.1 M CaCl?中进行5分钟的固化处理。

#### 2.4 聚合物溶液的表征（粘度和铺展性）
使用Brookfield DV-II数字粘度计（美国Brookfield）在室温下评估聚合物溶液（含或不含胰岛素和/或YCW）的流变行为，每个条件进行三次独立实验。铺展性通过将1.00 ± 0.01 g的每种配方置于两块水平玻璃板（20×20 cm）之间进行评估。在上板施加125 ± 1 g的重量后，1分钟内记录最终的铺展直径。粘度增加和铺展性降低被解释为微粒形成过程中结构完整性改善的指标。

#### 2.5 微粒表征
**微粒大小和形态**。使用配备数字相机（Olympus Optical）的立体显微镜（Nikon SMZ1000）观察微粒形态和表面外观。每批测量90个微粒的直径。测量在三个独立批次（n=3）中进行。

**胰岛素封装效率**。封装效率（EE）定义为通过反相高效液相色谱（RP-HPLC）测定的总封装胰岛素与吸收缓冲液总体积的比例。为了估计吸收体积和胰岛素负载，准确称重的冻干微粒（初始质量m?≈130 mg，n=3批次）浸入胰岛素溶液或pH 7.0的USP缓冲液中5分钟。取出微粒后，轻轻擦拭，重新称重（湿质量m(t)），并测量其湿直径（n=30微粒），然后在60°C下干燥至恒定质量（干质量m(dry)）。通过标准重力公式计算基质重量损失（%）、吸水率（%）和直径变化（%）。

**膨胀研究**。评估了含有或不含INS和YCW的MP在15分钟溶解后的膨胀行为：MP（2.4 g）引入50 mL pH 1.2或pH 6.8的缓冲液中，在37°C下搅拌（50 rpm）。15分钟后，所有MP被取出（三次重复），准确称重（湿质量(t)），测量湿直径(t)，并在60°C下干燥至恒定质量（干质量(t)）。基质重量损失（%）、吸水率（%）和直径变化（%）计算如下：基质重量损失（%）=（t?时的干质量 - t时的干质量）/ t?时的干质量 × 100，吸水率（%）= [（t时的湿质量 - t时的干质量） - （t?时的湿质量 - t?时的干质量）] / t?时的湿质量 - t?时的干质量 × 100，直径变化（%）= (t时的湿直径 - t?时的湿直径)/ t?时的湿直径 × 100。所有实验均进行三次重复。

#### 2.6 YCW的功能贡献
**体外胰岛素释放**。研究了未包衣和包衣的INS-MP在pH 1.2或pH 6.8的缓冲液中的胰岛素释放情况，每个实验进行四小时。在预定时间点取出样品（1 mL），离心（5000 rpm，5分钟），使用RP-HPLC方法测定胰岛素含量。所有实验均进行三次重复。胰岛素释放数据以时间对释放的累积百分比表示。为了定量比较，使用梯形法则计算从0到4小时的释放曲线面积（AUC?–4h）。

**酶抑制效应**。通过Sajeesh等（2010）和Khafagy等（2007）的方法评估了配方对肠道蛋白酶的抑制能力。选择胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶作为酶解实验中的模型蛋白酶，因为它们代表了小肠中蛋白质和肽类物质水解的主要丝氨酸蛋白酶。在胃排空后，胰腺分泌物提供了这些酶的高浓度（0.1-1 mg/mL），它们可以迅速在特定残基上切割胰岛素等肽类药物。胰蛋白酶优先在赖氨酸和精氨酸的C末端进行水解，而α-胰凝乳蛋白酶切割芳香残基（苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸）。这些酶共同构成了小肠中胰岛素和肽类物质的主要蛋白酶活性。之前的研究表明，这些酶在胰岛素存在的情况下迅速降解，导致超过80-90%的完整肽在几分钟内损失，使其成为预测小肠蛋白酶水解的最相关体外模型。因此，同时使用这两种酶可以代表胰岛素口服后遇到的蛋白酶屏障，并提供有意义的YCW配方保护或抑制能力的评估。

**胰岛素对抗酶解的保护作用**。为了评估对抗酶解的保护作用，INS-MP和INS-YCW-MP被分散在含有胰蛋白酶（10 IU/mL）和α-胰凝乳蛋白酶（10 IU/mL）的USP pH 7.4缓冲液中，并在37°C下孵育。在预定时间点，取出样品并用0.1% TFA水溶液停止反应。通过RP-HPLC测定缓冲液中的胰岛素含量，并在转移微粒至新鲜缓冲液并提取后测定与微粒结合的胰岛素含量。释放胰岛素的生物活性通过ELISA方法确认。对照组包括在无微粒情况下与酶孵育的天然胰岛素，以及在无酶条件下孵育的样品以确定完整胰岛素的百分比。所有实验均进行三次重复（n=3独立批次）。

**黏附性**。在兔子小肠黏膜上进行黏附性研究，如Rao和Buri（1989）所述，使用不同微粒：玻璃微粒（直径1000-1200 μm）、MP和YCW-MP。实验还包括YCW粉末的额外评估。玻璃微粒作为对照，因其与聚合物微粒具有相似的表面积。简而言之，从小肠中取出10厘米长的组织，用生理盐水（0.9% NaCl）冲洗以去除黏膜表面的自由黏液，并纵向切开。组织被安装在塑料支架上，与水平面成45度角，并用生理盐水冲洗。将20个微粒或200 μg的粉末施加在黏膜表面，并保持5分钟以进行微粒或粉末与黏膜的相互作用。随后，用pH 6.8的USP缓冲液在30分钟内冲洗组织。5、10或30分钟后，手动计数黏附在小肠组织上的微粒数量。对于YCW粉末，由于无法单独计数，将黏附的材料与黏液收集，冲洗并干燥后称重。黏附能力以最终过程后黏附在黏膜组织上的微粒或粉末的百分比表示。实验进行三次重复。

#### 2.7 YCW对Caco-2细胞胰岛素渗透性的影响
**细胞培养**。Caco-2人结肠癌细胞从美国典型培养物收藏库（ATCC，马里兰州，Rockville）获得，传代35-40。培养基为含4.5 g/L葡萄糖的DMEM，补充20%胎牛血清、2%维生素、2%非必需氨基酸、2% L-谷氨酰胺和2%抗生素溶液，于37°C的潮湿空气中培养（空气/CO?，95:5，v/v）。每三天更换培养基。6孔板Transwell多孔细胞培养支持物每孔接种5×10?个细胞，培养基每日更换。所有实验均在初始接种后21天进行，此时Caco-2细胞表现出最大分化。在每次实验前，移除培养基，用1 mL PBS冲洗细胞三次。

**单层完整性与细胞活力**。细胞毒性研究用于评估细胞在INS、YCW或MP存在下的活力。测试了1 mL的自由INS溶液（F-INS，300 μg/mL）和自由INS-YCW溶液（F-INS-YCW）。对于Caco-2细胞测试的F-INS，INS-MP（对应300 μg/mL的胰岛素）和INS-YCW-MP（对应300 μg/mL的胰岛素）被悬浮在1 mL的DMEM中，并施加到上腔室。细胞在37°C下孵育120分钟，评估其活力。通过台盼蓝排除法进行细胞活力评估（最终浓度0.1%）。同时，测量单层的TEER值以验证单层的融合和完整性。

**YCW对TEER的影响**。测量在处理前和预定时间点进行，对照组为无处理（NT）、未加载MP（MP）和实验组：自由YCW（F-YCW）和YCW加载MP（YCW-MP）。120分钟后，移除处理介质（溶液和/或MP），用PBS冲洗细胞，立即更换新鲜培养基，并在37°C下孵育。单层被允许在37°C下再生48小时，在95%空气和5% CO?（90%相对湿度）环境中。作为细胞活力和单层完整性的度量，TEER在孵育过程中和再生期48小时内进行记录。

TEER根据以下公式计算：TEER（Ω·cm2）=（R_total - R_filter）× A，其中R_total（Ω）是测量的电阻，R_filter（Ω）是无细胞的过滤器电阻，A是表面积（cm2）。

**胰岛素渗透性**。为了评估运输，自由INS溶液（F-INS，300 μg/mL）、自由INS-YCW溶液（F-INS-YCW，相当于300 μg/mL）、INS-MP（相当于300 μg/mL）和INS-YCW-MP（相当于300 μg/mL）被悬浮在1 mL的DMEM中，并加入上腔室。细胞在37°C下孵育120分钟。120分钟后，取出0.5 mL的基底腔室溶液，并通过RP-HPLC分析INS浓度。所有实验均进行三次重复。结果以表观渗透系数（P_app）表示，计算如下：P_app（cm·s?1）= (dQ/dt) × [1/(A·C?)]，其中dQ/dt是胰岛素跨单层的通量（mol/sec），C?是上腔室中胰岛素的初始浓度（mol/mL），A是单层的表面积（3.14 cm2）。P_app值以cm·s?1表示，计算时间为实验的120分钟。回收率根据以下公式计算，以验证每项实验的物质平衡：回收率（%）= (Q_basolateral_t120 + Q_apical_t120) / Q_apical_t0 × 100，其中Q_basolateral_t120是120分钟孵育后基底腔室中的胰岛素总量，Q_apical_t120是剩余在上腔室中的胰岛素总量，Q_apical_t0是最初加入上腔室的胰岛素总量。所有Caco-2实验均进行三次重复（n=3个插入物每条件）。

#### 2.8 体外模型中的YCW对胰岛素渗透性的影响
**实验条件**。YCW对胰岛素渗透性的影响在体外模型中进行，包括未处理（NT）、未加载MP（MP）和实验组：自由YCW（F-YCW）和YCW加载MP（YCW-MP）。实验组在37°C下孵育120分钟，测量TEER变化。

**胰岛素渗透性**。通过计算P_app值评估了胰岛素的渗透性，其中P_app值为cm·s?1。所有实验均进行三次重复（n=3个插入物每条件）。

#### 2.9 体内小肠吸收与药代动力学
**动物实验**。所有实验均在法国Clermont-Ferrand的CEMEA Auvergne伦理委员会批准下进行（APAFIS #29153-2021011417345249 v2）。实验使用健康的雄性Wistar大鼠，体重300 ± 20 g。大鼠在控制条件下饲养，温度22 ± 3°C，12小时光/暗周期（早上8点至晚上8点）。大鼠自由获取商业颗粒饲料和自来水。在实验前12-16小时禁食，使用Imalgene 1000?和Valium 10?（每100 g大鼠150 μL和50 μL）进行麻醉，并局部使用1% Xylocaine?。

**十二指肠给药模型**。药代动力学研究在健康的雄性Wistar大鼠中进行，体重如前所述。大鼠被分为4组，每组6只。由于微粒直径约为1.4 mm，不能可靠地通过灌胃给药，因此使用了之前用于小肠吸收研究的直接十二指肠给药模型。在麻醉状态下，制作一条中线腹部切口（约1.5 cm）以暴露近端小肠。在胃部之后约2 cm处制作一条小纵向切口（0.5 cm），将INS-YCW-MP（对应于730 μg/mL的人胰岛素）插入到肠腔中。阴性对照实验通过将自由胰岛素溶液（730 μg/mL的人胰岛素）和INS-MP（730 μg/mL的人胰岛素）以相同方式插入肠腔中进行。切口随后用缝线密封。阳性对照通过在大鼠皮下注射730 μg/mL的人胰岛素溶液进行。

在实验前和120分钟后，从颈动脉导管收集300 μL的血液，放入肝素化试管中。血液在10,000 g下离心5分钟，分离血浆并储存于-20°C，直至进一步分析。通过ELISA技术评估血浆中人胰岛素的免疫反应性。人胰岛素ELISA试剂盒不会与大鼠胰岛素交叉反应，因此内源性胰岛素不会干扰结果，从而允许对给药的人胰岛素进行选择性检测。口服给药的药理可用性（PA）通过以下公式计算：PA（%）=（AUC_duodenal / AUC_sc）× 100，其中AUC_duodenal是十二指肠给药后确定的面积，AUC_sc是皮下注射胰岛素溶液后确定的面积。

**共聚焦显微镜下的小肠吸收可视化**。为了可视化局部给药，大鼠被分为两组（每组2只）：未负载MP（对照）和INS-FITC负载的YCW-MP（INS-FITC-YCW-MP）。按照体内评估方法将样品引入大鼠的十二指肠中。未暴露于荧光标记MP的十二指肠组织被用作阴性对照，以排除组织自发荧光的可能性。在60分钟的孵育后，将受试十二指肠组织的2 cm段迅速在两端结扎并移除。将十二指肠快速冷冻在异戊烷中，并嵌入到OCT（最佳切割温度介质）中，储存于-80°C。使用冷冻切片机切割7微米的冷冻十二指肠组织。然后将十二指肠黏膜固定在1% PFA中20分钟，用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，并用Hoechst染色核。使用Mountex封片介质（CellPath）封片。通过Zeiss LSM 510 Meta共聚焦显微镜（Carl Zeiss, Inc）进行观察。未暴露的十二指肠组织作为阴性对照，以排除组织自发荧光的可能性。

### 3. 结果与讨论

#### 3.1 YCW对聚合物溶液特性的影响
**粘度和铺展性**。不同配方制备的聚合物溶液的粘度和铺展性如图2所示。观察到粘度与铺展直径之间存在强反向相关性（R2=0.9903）：粘度较高的溶液产生了较小的铺展直径。胰岛素的加入显著降低了溶液粘度并增加了铺展性，表明胰岛素干扰了蛋白质-多糖相互作用，生成了结构较少的凝胶网络。粘度的降低不利于机械稳定和球形微粒的生产。

**重要发现**。重要的是，YCW的加入恢复了溶液的粘度，抵消了胰岛素的稀释效应，使得微粒的形成更球形且机械稳固。这表明YCW通过增加前驱水凝胶中分子间相互作用的密度来贡献于配方的结构。在微粒形成过程中，基质/胰岛素离子相互作用（Whitehead等，2004；Pamies等，2010）可能改变凝胶化行为，有时微小的WP浓度变化会导致变形或脆弱的微粒。YCW的存在稳定了前驱混合物，这可能帮助在后续处理（负载和包衣）期间保留胰岛素。这些发现与之前报道一致，即酵母或YCW的加入可以增加生物聚合物溶液的粘度并改善其机械稳定性（Yuasa等，2002；Zhao等，2009；Hébrard等，2010）。

#### 3.2 YCW对微粒特性的影响
**微粒制备**。胰岛素负载微粒（INS-MP）通过挤出和冷Ca2?诱导的凝胶化制备，如图3所示。凝胶化后，微粒被冻干，并通过吸收/吸附方式从胰岛素溶液中加载胰岛素。显微镜确认微粒在冻干后仍保持球形，表明干燥步骤没有破坏结构。平均微粒直径约为1467 ± 101 μm，与YCW含有的未包衣微粒（YCW-MP=1470 ± 90 μm）没有显著差异。YCW在2% w/w时未改变挤出滴形成或凝胶化过程，导致类似的微粒尺寸分布。

**包衣**。INS-MP和INS-YCW-MP通过简单的浸入和Ca2?固化步骤成功包衣，得到个体包衣的球形微粒。通过比较包衣前后的微粒直径评估包衣厚度（见表1）。

所有包衣配方均显示出稍高的平均直径（从1535 ± 92 μm到1570 ± 94 μm），与未包衣对照相比，确认了外部层的成功沉积。统计学上显著增加的尺寸（p < 0.01）出现在ALG包衣配方和ALG-YCW包衣配方中，与未包衣MP相比，而包衣含有或不含WP和YCW的配方之间没有差异，表明YCW并未影响包衣厚度。

尽管YCW通常被视为不溶性颗粒或悬浮液，而非真正的聚合物溶液，但其在包衣过程中的加入减少了包衣期间胰岛素的损失。当YCW加入包衣溶液时，胰岛素泄漏减少了约10%（ALG）和8%（WP），而当YCW加入微粒核心前进行包衣时，减少了约22-25%。我们将这种改进的保留归因于YCW提供的增加粘度和结构凝聚力，这可能减缓包衣期间胰岛素从微粒中扩散，并稳定胰岛素-基质相互作用。

**微粒膨胀**。在胃酸pH 1.2和肠道pH 6.8下的膨胀行为（基质重量损失、吸水和直径变化）如图4和图5所示。在两种pH值下，胰岛素负载显著增加了水吸收、直径扩展和基质重量损失，与未负载微粒相比（见图5A）。这与负电荷ALG链和胰岛素之间的静电排斥有关，这会破坏网络并促进水渗透。在pH 6.8下，ALG羧酸基团去质子化，增加了静电排斥并促进了聚合物的松弛和膨胀；这解释了在肠道pH下观察到的较高膨胀和较高质量损失。

YCW的加入改变了膨胀曲线。YCW含有的微粒显示出更高的基质松弛和结构弱化（见图5B），与不含YCW的微粒（见图5A）相比，表明YCW干扰了WP和ALG之间的聚合物-聚合物堆积，可能通过干扰氢键和其他弱分子间力（如范德华相互作用）来实现。在蛋白质/多糖系统和YCW含有的包衣中，已描述了类似网络凝聚力的调节（Yuasa等，2002；Hébrard等，2010）。这些数据表明，虽然YCW在制造过程中对粘度和胰岛素保留有积极作用，但它可能在膨胀过程中促进结构软化和易变形，尤其是在肠道pH下，此时凝胶已经较松弛。

总体而言，膨胀行为很重要，因为它预示了释放动力学。吸收更多水并以pH 6.8下更快结构松弛的配方预计会通过扩散更快释放胰岛素。

#### 3.3 YCW对胰岛素输送的功能贡献
**体外胰岛素释放**。为了克服胃肠道屏障，理想的口服配方应（i）限制胃中胰岛素释放，（ii）确保在小肠吸收部位的快速可用性。因此，我们评估了所有微粒配方在模拟胃液（pH 1.2）和模拟肠液（pH 6.8）中的胰岛素释放情况，持续4小时（见图6）。

在两种介质中，未包衣YCW-MP和包衣MP（使用ALG/WP或ALG-YCW/WP-YCW聚合物）均显示出初始爆发后缓慢释放的曲线。胰岛素释放显然由扩散机制控制，如Harland模型所示（A > B），而非由侵蚀。初始爆发可以归因于靠近微粒表面的胰岛素分子的扩散，而缓慢阶段可能对应于微粒内部聚合物基质中的扩散。这些观察与之前描述的膨胀实验一致，表明在两种pH条件下基质侵蚀有限。

为了定量比较释放动力学，使用梯形法则计算每个重复的释放曲线面积（AUC?–4h），并进行统计分析（n=3）。结果（见图6，右图）显示，胰岛素释放在pH 6.8下显著快于pH 1.2，如反映在更高的AUC值（***p < 0.001）所示，这与pH依赖的海藻酸网络松弛有关。在酸性pH下，海藻酸保持紧凑，由于羧酸基团的质子化，而在pH 6.8下去质子化增加了静电排斥，导致更大的膨胀和增强的扩散。当比较未包衣配方时，YCW-MP在pH 1.2下仅表现出轻微的AUC?–4h增加（***p < 0.001），而在pH 6.8下没有显著差异（ns，p > 0.05）。这表明YCW在中性介质中并未显著影响胰岛素扩散，尽管它可能在酸性条件下略微削弱聚合物网络，通过减少ALG/WP基质内的链-链相互作用。在包衣系统中，所有配方（WP包衣、ALG包衣、WP-YCW包衣和ALG-YCW包衣MP）均表现出快速的胰岛素释放，在第一个小时内达到80-100%。统计比较确认了未包衣与包衣配方之间的显著差异（****p < 0.0001），但没有发现不同包衣配方之间的显著差异，表明聚合物类型或YCW在包衣中的加入均未显著改变AUC?–4h值。包衣中缺乏延长释放的效应，可以通过所用包衣的性质来解释：薄的、食品级的蛋白质或海藻酸层通过浸入形成，它们在水性介质中迅速水合并渗透。这些包衣在微粒制备期间有效地限制了胰岛素的损失，但在溶解过程中并未表现出肠靶向或扩散控制的屏障作用。因此，胰岛素释放仍主要由水合聚合物网络中的扩散控制，而不是由侵蚀或包衣阻力。

我们的结果与Yuasa等（2000, 2002）的研究不一致，他们使用了含有5%（w/v）酸处理YCW水分散液和0.35%（w/v）甘油的醋氨酚片剂。这些包衣片剂的释放显示出S形曲线，具有初始滞后期。然而，Yuasa等（2002）还测试了包衣的颗粒。与片剂不同，包衣颗粒的释放显然迅速，如我们的结果所示。

尽管缺乏显著的释放延迟效应，但YCW和聚合物基质的黏附性和保护性能仍然具有优势。这些配方的黏附性可能促进小肠表面的局部微环境，有利于药物吸收。然而，对于口服给药，应考虑额外的胃肠道屏障——要么通过在流化床系统中应用更厚的包衣，要么通过将微粒封装在肠衣胶囊中，如Ivanova等（Ivanova）所建议的。在这些条件下，预计会在小肠中迅速释放药物。同样，关于益生菌封装的研究表明，用S. cerevisiae细胞壁包衣的Lactobacillus acidophilus显示出对胃肠道条件的增强抗性，进一步支持了酵母衍生包衣的保护作用（Utama等，2023）。

**YCW的酶抑制效应**。快速释放本身不足以实现口服输送，如果胰岛素立即被小肠蛋白酶降解。YCW封装仍可能通过其潜在的酶抑制特性来提高胰岛素的口服生物利用度。因此，快速释放靠近小肠边界仍可能有利于药物吸收，如果胰岛素能被酶解保护。这种方法尤其有价值，因为一些聚合物已显示出酶抑制效应（Sajeesh等，2010），这可以有助于在口服输送期间保持蛋白质。在本研究中，YCW的抑制效应进行了评估。选择胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶作为模型蛋白酶，因为它们在降解口服蛋白质中起着至关重要的作用（Sajeesh和Sharma，2011）。聚合物和YCW对胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的体外抑制效应如图7所示。YCW-MP对胰蛋白酶和α-胰凝乳蛋白酶的抑制效果分别为65%和70%，这比WP/ALG MP的抑制效果显著更强。酶对底物的降解减少，表明酶优先降解YCW中的某些肽，然后其蛋白酶活性被抑制。这表明酶优先与YCW衍生肽或多糖相关蛋白域相互作用并部分降解，从而减少其对胰岛素的有效活性。这种“牺牲底物”行为已被建议用于多糖和蛋白质为基础的蛋白酶抑制剂（Sajeesh等，2010）。

**胰岛素对抗酶解的保护作用**。接下来在pH 7.4的缓冲液中评估胰岛素在胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶存在下的降解（见图8）。60分钟后，无论封装在MP还是YCW-MP中，约60%的胰岛素保持完整，而自由胰岛素则迅速降解。ELISA确认了与微粒结合的胰岛素保留了免疫反应性，表明其结构完整性得到了保留。

有趣的是，尽管YCW-MP表现出更强的酶抑制效果，但在60分钟内，MP和YCW-MP在胰岛素保护方面的比例没有显著差异。这可能是因为，在小肠pH下，所有配方中的胰岛素在第一个小时内释放约90%，因此一旦胰岛素扩散到介质中，两种配方都同样暴露于酶。换句话说，YCW帮助抑制酶，但快速释放限制了其优势的表达窗口。

总体而言，这些数据表明，胰岛素对抗酶解的保护主要由胰岛素与聚合物基质的短暂物理结合提供，而不是YCW的长期屏蔽效应。

**YCW含有的系统的黏附性**。黏附性预计会增强在吸收表面的局部滞留时间并促进接触驱动的吸收。根据Rao和Buri（1989）的方法评估了YCW含有的配方的黏附性，该方法被广泛用于测定生物粘附强度。考虑黏附的YCW-MP或YCW粉末的百分比作为黏附能力的主要指标（见图9）。结果表明，MP和YCW-MP均表现出对小肠黏膜的强黏附性，超过90%的微粒在30分钟的冲洗后仍附着。YCW粉末的黏附性与微粒配方相当。统计分析确认了MP、YCW-MP和YCW粉末之间没有显著差异（p > 0.05），而所有配方均显著不同于无黏附性对照（玻璃微粒，***p < 0.001）。这些发现表明，海藻酸/乳清蛋白基质的内在黏附性已经很高，而YCW的加入在测试条件下并未进一步增加黏附性。

YCW粉末和聚合物微粒的相似黏附性表明，YCW主要通过其表面生物聚合物（β-葡聚糖、甘露