配方和工艺参数对雾化过程中载有RNA的脂质纳米颗粒稳定性和生物活性的影响

《European Journal of Pharmaceutical Sciences》：Impact of formulation and process parameters on the stability and bioactivity of RNA-loaded lipid nanoparticles during nebulization

RNA纳米颗粒吸入给药的物理化学稳定性与生物活性研究。分析了siRNA和mRNA脂质纳米颗粒（LNPs）经振动筛网雾化器处理后粒子大小、Zeta电位、RNA释放及体外功能的变化。发现siRNA LNPs在雾化后仍保持RNA完整性和基因沉默活性，而mRNA LNPs因结构不稳定性导致RNA降解和表达效率显著降低。研究表明需根据RNA类型优化LNPs配方及雾化参数。

　　在过去的几十年中，RNA作为一种治疗和预防疾病的新型药物载体，尤其是在新冠疫情期间，因其在疫苗开发中的关键作用而备受关注。RNA因其独特的生物活性和快速的开发周期，被广泛应用于多种疾病的治疗中。然而，RNA分子本身具有一定的不稳定性，容易受到水解和核酸酶降解的影响。因此，开发有效的RNA递送系统成为研究的重点。脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticles, LNPs）作为RNA的载体，因其能够保护RNA免受降解、促进细胞摄取和促进内体逃逸而备受青睐。

LNPs通常用于静脉或肌肉注射，而由于肺部具有较大的表面积、丰富的血管网络以及较低的核酸酶浓度，吸入式给药成为一种具有潜力的替代方式。这不仅适用于局部治疗，还可能实现全身性药物输送。然而，目前关于LNPs通过吸入方式给药的研究仍处于探索阶段，尤其是振动网雾化器（Vibrating Mesh Nebulizers, VMNs）在RNA递送中的应用。VMNs因其患者友好性和高剂量输送能力，成为一种重要的吸入给药平台。但该过程可能对LNPs的物理化学性质和生物活性产生影响，包括温度升高、机械应力以及整体能量消耗等因素。

本研究旨在系统评估VMNs对不同RNA类型LNPs的影响，包括其物理化学特性和生物活性。通过比较不同配方和给药参数对LNPs性能的影响，研究人员希望揭示吸入给药过程中LNPs的稳定性问题，并为未来开发适用于吸入给药的RNA制剂提供理论依据。研究对象包括两种主要的RNA类型：小干扰RNA（siRNA）和信使RNA（mRNA）。这两种RNA在结构和稳定性上存在显著差异，siRNA通常较短且为双链结构，而mRNA则较长且为单链结构。这种结构差异可能导致两者在VMNs处理过程中表现出不同的行为。

为了实现这一目标，研究团队选择了两种常见的VMNs设备：PARI eFlow Rapid和Aerogen Pro。这两种设备在药物雾化过程中均能产生1-5微米范围内的气溶胶，这被认为是肺部沉积的最佳尺寸范围。然而，它们在几何结构、残余体积和能量消耗方面存在差异。例如，Aerogen Pro设计为将药物溶液置于振动网的上方，几乎不产生残余体积，而PARI设备则保留了更多的残余体积，可能是为了缓冲雾化过程中的温度上升。此外，PARI设备的振动网与药物溶液呈90度角，而Aerogen设备则为垂直或略微倾斜的设置。

研究团队制备了三种不同的LNP配方，分别基于已批准的Onpattro?、Comirnaty?和Spikevax?制剂。这些配方中包含了不同的脂质成分，包括可离子化脂质、辅助脂质、聚乙二醇化脂质以及固醇类成分。其中，siRNA LNPs的浓度为2 mM，而mRNA LNPs的浓度为1 mM。RNA被稀释在25 mM的醋酸钠缓冲液中，pH值为4.0。随后，通过不同的混合方法（如Impingement Jet Mixer NanoScaler或herringbone mixer）制备LNPs，并通过透析进一步纯化。最终，LNPs被过滤并储存于4°C。

在雾化过程中，研究团队使用了冰冷却的试管来收集雾化样品，以尽量减少温度变化对RNA稳定性的影响。对于不同的RNA类型，雾化样品被分别稀释在0.9%的氯化钠溶液和磷酸盐缓冲液（PBS）中。siRNA LNPs的浓度为20 ng/μl和8 ng/μl，而mRNA LNPs的浓度为3 ng/μl。为了评估雾化对LNPs物理化学特性的影响，研究人员使用了激光衍射技术分析气溶胶的粒径分布，并结合动态光散射（DLS）和纳米颗粒追踪分析（NTA）来测定粒径和电位变化。同时，通过RiboGreen检测法评估RNA释放情况，以了解雾化过程中RNA是否从LNPs中释放出来。

研究结果显示，对于siRNA LNPs，雾化后粒径有所增加，但RNA完整性保持良好，且生物活性未受影响。这表明，尽管雾化过程可能引起一定的物理变化，但这些变化并未显著影响siRNA的保护效果、细胞摄取和内体逃逸能力。相比之下，mRNA LNPs在雾化后表现出显著的RNA降解现象，导致生物活性下降。这一现象可能与mRNA的结构特点有关，如其较长的长度和单链特性，使其更容易受到机械应力和化学降解的影响。此外，雾化过程中可能引起的粒子聚集和结构变化也可能是导致mRNA降解的原因之一。

研究还探讨了雾化设备对LNPs性能的影响。尽管PARI设备的能量输入较高，但其对LNPs的物理化学性质和生物活性的影响并未显著高于Aerogen设备。这表明，在当前的实验条件下，雾化设备的选择可能对LNPs的稳定性影响较小。然而，对于mRNA LNPs，两种设备均未能有效防止其降解，这提示需要进一步优化配方或雾化条件，以减少物理和化学因素对mRNA的不利影响。

在生物活性评估方面，研究团队通过体外实验检测了siRNA和mRNA LNPs对基因沉默和蛋白表达的影响。结果显示，siRNA LNPs在雾化后仍能保持其生物活性，而mRNA LNPs则表现出明显的功能下降。这一结果支持了将siRNA LNPs用于吸入给药的可行性，但也强调了mRNA LNPs在吸入给药过程中需要特别关注其稳定性问题。

此外，研究还讨论了体外与体内研究之间的差异。体外模型通常无法完全反映体内条件，尤其是在涉及复杂的生物环境时。因此，体外实验结果可能无法直接预测体内疗效。为了提高体外与体内结果的一致性，研究建议采用更先进的模型，如黏液渗透实验、气液界面培养和精准切割肺片等，以更全面地评估LNPs的性能。

综上所述，本研究揭示了振动网雾化对不同RNA类型LNPs的影响，并强调了在开发适用于吸入给药的RNA制剂时，需要综合考虑配方优化、物理化学特性评估以及生物活性检测。研究结果不仅为未来吸入式RNA药物的开发提供了重要的参考，也提示了在临床应用中，针对不同RNA类型进行特异性优化的必要性。通过进一步探索脂质配方、添加稳定剂以及改进雾化技术，有望提高吸入式RNA药物的稳定性和有效性，从而拓展其在多种疾病治疗中的应用前景。