克服合成方面的挑战，并评估MOG-Fc-双功能肽抑制剂在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）中的体内疗效

《Bioconjugate Chemistry》：Overcoming Synthetic Challenges and Evaluating in Vivo Efficacy of the MOG-Fc-Bifunctional Peptide Inhibitor for EAE in Mice

多发性硬化症（MS）是一种自身免疫性疾病，以中枢神经系统脱髓鞘为特征。针对MS的罕见形式原发进行性多发性硬化症（PPMS），本研究通过sortase酶介导连接技术合成MOG-Fc-BPI融合蛋白（含抗原肽MOG、信号阻断肽LABL及IgG1 Fc域），并在MOG诱导的EAE小鼠模型中验证其疗效。结果显示，MOG-Fc-BPI组小鼠在疾病第19天临床评分归零，且体重增长稳定，而对照组小鼠出现进行性体重下降和神经系统症状。该研究首次成功解决了MOG肽疏水性导致的合成难题，并证实了抗原特异性调节免疫细胞分化（Th1/Th17→Treg）的治疗机制，为PPMS提供了新的治疗策略。

　　多发性硬化症（Multiple Sclerosis, MS）是一种自身免疫性疾病，其主要特征是中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中神经元的退化。这种疾病的发生是由于免疫系统错误地攻击包裹神经元的髓鞘鞘，导致炎症、脱髓鞘、轴突损失以及胶质细胞增生。随着神经退化的进展，MS患者会经历不同程度的生理和认知功能障碍。MS的发病机制复杂，根据引发免疫反应的抗原蛋白不同，患者可能发展为不同的疾病类型，如复发缓解型MS（Relapse-Remitting MS, RRMS）、继发进展型MS（Secondary Progressive MS, SPMS）、原发进展型MS（Primary Progressive MS, PPMS）以及进行性复发型MS（Progressive Relapsing MS, PRMS）。其中，PPMS是较为罕见的一种形式，影响着约10%至15%的MS患者，其特点是疾病持续进展，缺乏缓解期。而RRMS则是最常见的类型，占MS患者的87%，这些患者会经历疾病进展期和缓解期交替出现的过程。随着病情的发展，大部分RRMS患者最终会转变为SPMS，进入不可逆的神经损伤阶段。PRMS则是最不常见的类型，约占MS患者的5%，患者在疾病进展过程中会经历症状波动。

PPMS的治疗一直是一个重大挑战，因为现有的治疗方法往往只能部分缓解症状或延缓疾病进展，而无法彻底抑制疾病的发展。目前，Ocrelizumab是唯一被美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于PPMS治疗的药物，它虽然在某些情况下可以有效控制疾病，但其作用仅限于延缓病情恶化，而不能完全阻止疾病的进行。此外，由于Ocrelizumab是一种广谱免疫抑制剂，可能会导致患者更容易受到感染，如进行性多灶性白质脑病（Progressive Multifocal Leukoencephalopathy, PML）。因此，寻找更精准、更安全的治疗策略对于PPMS患者尤为重要。

针对这一问题，研究团队设计了一类新型的治疗分子，称为双功能肽抑制剂（Bifunctional Peptide Inhibitors, BPIs）。这类分子由两个肽段组成：一个抗原肽（如髓鞘蛋白PLP、MBP或MOG）和一个信号2阻断肽（如LABL肽）。通过特定的连接子将这两个肽段连接起来，BPIs能够在抗原特异性基础上调节T细胞的分化方向，从促炎性的Th1和Th17细胞转变为调节性的T细胞（Regulatory T Cells, Tregs）。这种调节机制有助于恢复免疫系统的平衡，从而减少对髓鞘鞘的攻击，延缓神经退化。

在本研究中，MOG-Fc-BPI被设计为一种潜在的治疗药物，用于抑制MOG刺激引发的实验性自身免疫性脑脊髓炎（Experimental Autoimmune Encephalomyelitis, EAE），这是一种用于模拟PPMS的动物模型。MOG（髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）是与PPMS密切相关的抗原蛋白，因此MOG-Fc-BPI的开发具有重要意义。为了提高其在体内的稳定性，研究者采用了一种基于IgG1抗体Fc结构域的连接方式，将MOG肽与LABL肽通过Sortase A酶介导的连接反应结合在一起。这种方法不仅提高了MOG-Fc-BPI的血浆半衰期，还增强了其治疗效果。

在实验过程中，MOG-Fc-BPI的合成与纯化是一项技术挑战。由于MOG肽的疏水性较强，直接表达会导致其在反应体系中形成沉淀，影响后续的纯化与分析。因此，研究团队采用了一种改进的策略，即在MOG肽的C端添加了三个甘氨酸（Gly）和五个精氨酸（Arg）的修饰，使其能够更好地与Sortase A酶反应，从而提高反应效率和产物的稳定性。此外，为了进一步优化MOG-Fc-BPI的体外稳定性，研究者还设计了一种新的缓冲液配方，包括0.1 M磷酸钠、0.15 M氯化钠和50 mM蔗糖，pH值为7.2。这种缓冲液不仅能够维持MOG-Fc-BPI在15 mg/mL浓度下的稳定性，还有效防止了蛋白质聚集和沉淀的形成。

为了评估MOG-Fc-BPI的治疗效果，研究者在C57BL/6小鼠模型中进行了实验。实验中，将MOG肽与完全弗氏佐剂（Complete Freund’s Adjuvant, CFA）混合，并加入灭活的结核杆菌H37RA，以诱导EAE。随后，将小鼠分为两组：一组接受MOG-Fc-BPI治疗，另一组则接受PBS作为对照。结果显示，接受MOG-Fc-BPI治疗的小鼠在第19天时疾病评分降至0，表明疾病得到了完全抑制，而接受PBS治疗的小鼠在疾病高峰期（第25天）的平均评分为3，表明出现了完全的后肢瘫痪。此外，MOG-Fc-BPI治疗的小鼠在整个实验期间体重持续增加，而PBS治疗的小鼠则在第13至第17天体重显著下降，且在实验结束时仍未恢复。这些结果表明，MOG-Fc-BPI不仅能够有效抑制EAE的进展，还能维持小鼠的生理状态，避免因疾病导致的体重下降。

MOG-Fc-BPI的治疗机制涉及两个主要途径：其一是通过与未成熟树突状细胞（Immature Dendritic Cells, iDC）的相互作用，阻止信号2的形成，从而引导T细胞向调节性T细胞（Tregs）分化；其二是通过与成熟树突状细胞（Mature Dendritic Cells, mDC）的结合，同时阻断信号2的形成，防止T细胞向促炎性Th17或Th1细胞分化。这两种机制共同作用，有助于抑制EAE的进展，并恢复免疫系统的平衡。

此外，研究者还发现，MOG-Fc-BPI的治疗效果优于传统的BPI分子。例如，MOG-Fc-BPI能够在较低剂量下（2次35 nmol注射）完全抑制EAE，而传统的MOG-BPI则需要更高的剂量（3次100 nmol）才能达到相似的效果。这表明，通过使用Fc结构域作为连接子，可以显著提高BPI分子的治疗效率，同时减少可能的副作用，如过敏反应。在某些情况下，MOG-Fc-BPI的治疗可能导致免疫系统对这些分子产生反应，从而引发抗体的产生，进而导致IgE介导的超敏反应。为了解决这一问题，研究者建议采用不同的给药途径，如皮下、皮内或口服，以降低过敏反应的发生率。此外，通过逐步增加剂量，也可以避免由于初始剂量过高而引发的不良反应。

尽管MOG-Fc-BPI在体外和体内实验中表现出良好的治疗效果，但其合成和纯化过程仍然面临一定的技术难题。传统的连接方法（如裂解蛋白连接或使用化学连接子）往往会导致蛋白质的聚集和沉淀，影响最终产品的质量和稳定性。因此，研究团队采用了一种基于Sortase A酶的连接方法，这种方法能够有效避免这些问题，并提高产物的纯度和稳定性。此外，研究者还探索了其他连接方法，如分裂内肽连接（Split Intein Ligation），但这种方法在实际操作中仍然存在一定的局限性，尤其是在处理疏水性较强的MOG肽时，容易导致产物的聚集和沉淀。

总的来说，MOG-Fc-BPI作为一种新型的抗原特异性治疗药物，具有广阔的应用前景。它不仅能够有效抑制PPMS相关的EAE，还能够在较低剂量下达到良好的治疗效果，从而减少潜在的副作用。此外，通过优化其合成和纯化过程，研究者成功克服了MOG-Fc-BPI在体外研究中的稳定性问题，使其能够在体内维持较高的浓度，确保治疗的有效性。随着进一步的研究和开发，MOG-Fc-BPI有望成为PPMS治疗的一种新型选择，为患者提供更安全、更有效的治疗方案。