利用质谱技术对肾上腺皮质肿瘤进行比较蛋白质组学分析

《Journal of Proteome Research》：Comparative Proteomic Profiling of Adrenocortical Neoplasia Using Mass Spectrometry

本研究通过LC-MS/MS和生物信息学分析，比较了正常肾上腺组织与肾上腺皮质腺瘤（ACA）、癌（ACC）和原发性大结节性肾上腺增生（PMAH）的蛋白质组差异，发现ACA、ACC和PMAH与正常组织相比分别有27、49和81个差异表达蛋白（DEPs），其中RBM3、SOD3等关键蛋白在不同肿瘤中呈现特征性表达变化，并通过独立队列验证了数据的可靠性，为肾上腺疾病分子机制和诊断治疗靶点提供新依据。

　　近年来，随着高通量分子分析技术的快速发展，我们对肾上腺皮质疾病分子机制的理解得到了显著提升。为了揭示可能与疾病特异性发病机制相关的蛋白质特征，本研究采用液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）和生物信息学方法，比较了正常人肾上腺（NHA）组织、肾上腺皮质腺瘤（ACA）、肾上腺皮质癌（ACC）以及原发性大结节性肾上腺皮质增生（PMAH）肿瘤样本之间的蛋白质组特征，包括有无ARMC5突变的情况。研究共鉴定了7350种蛋白质，并对其中3976种进行了定量分析。在ACA与NHA比较中发现了27种差异表达蛋白（DEPs），在ACC与NHA比较中发现了49种DEPs，而在PMAH与NHA比较中则发现了81种DEPs。当比较ACC与ACA时，发现了64种上调蛋白和48种下调蛋白。在PMAH伴有ARMC5突变（PMAHw）与无ARMC5突变（PMAHwt）的比较中，DEPs数量最少，仅有12种上调蛋白和4种下调蛋白。这些结果通过来自首尔国立大学医院的独立ACC队列进行了验证，结果显示整体相似度高达99.8%，且无显著差异。这项研究通过全面的NHA、ACA、ACC和PMAH蛋白质组分析，为正常肾上腺功能及肿瘤相关变化提供了新的见解。研究提供了高质量的蛋白质组数据集，突出了潜在的生物标志物和治疗靶点，并为理解肾上腺皮质疾病机制做出了重要贡献。

肾上腺皮质的结节性病变、腺瘤和癌变是肾上腺皮质的常见改变。其中，一种常见的结节性病变是散发性肾上腺皮质增生。相比之下，微结节性和大结节性肾上腺皮质增生是较为罕见的状况，通常与胚系致病性突变有关。原发性大结节性肾上腺皮质增生（PMAH）在近一半的家族性病例中由ARMC5的致病性变异引起，而在某些遗传性食物依赖性库欣综合征中则更罕见地由KDM1A失活导致。所有这些情况都被视为克隆性良性增生，库欣综合征是其临床表现之一，具体取决于皮质醇分泌水平。肾上腺皮质腺瘤（ACA）是肾上腺皮质最常见的肿瘤，当它们产生激素时，可能涉及醛固酮或皮质醇的产生。功能性腺瘤导致原发性醛固酮增多症，可能伴随某些离子通道基因的体细胞和，有时，胚系突变以及Wnt通路效应因子β-连环蛋白（CTNNB1）的激活，从而增加醛固酮的产生和细胞增殖。功能性腺瘤产生皮质醇时，表现出PKA通路的基因改变，而CTNNB1变异是无功能腺瘤中最常见的分子改变，尤其是在较大的肿瘤中。肾上腺皮质癌（ACC）是一种罕见疾病（1–2例/百万），其临床表现包括库欣综合征或男性化-女性化综合征，由于激素的产生。根据世界卫生组织（WHO）2022分类系统，肾上腺皮质癌被分为形态学亚型，包括经典型或常规型（97%）、上皮样型（2%）、黏液型（<1%）和肉瘤样型（<1%）。该分类考虑了血管侵犯在诊断和预后评估中的作用，同时结合有丝分裂计数和Ki-67标记指数进行风险分层。ACC的分子研究已识别出体细胞变异、甲基组和微RNA表达谱，以进行分类、预测预后和发现新的治疗靶点。因此，由于高通量分子分析的应用，我们对肾上腺皮质疾病，特别是肾上腺皮质癌的分子发病机制的理解近年来取得了显著进展。液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）提供了一种用于在生物样本中识别和量化广泛蛋白质的方法。它旨在增强我们对生物过程的理解，揭示其潜在机制，并改善疾病的诊断和预后评估。

为了阐明疾病特异性特征并深入了解肾上腺皮质疾病的发病机制，我们在此研究中采用了基于LC–MS/MS的蛋白质组分析，比较了肾上腺皮质腺瘤、常规肾上腺皮质癌和双侧大结节性肾上腺疾病样本，并与正常人肾上腺组织进行了对比。为了验证结果，我们使用了一个独立的ACC队列，结果显示整体平均相似度达到99.8%。这项研究不仅展示了LC–MS/MS技术在揭示蛋白质组特征方面的潜力，也为进一步的临床研究和治疗策略提供了重要依据。

在本研究中，我们首先从圣保罗大学的尸体解剖服务中获取了两名男性和三名女性的正常人肾上腺组织样本（NHA，n = 5），然后从圣保罗大学医学院医院获得了一系列肾上腺皮质肿瘤和增生样本，包括肾上腺皮质腺瘤（ACA，n = 8）、肾上腺皮质癌（ACC，n = 8）以及原发性大结节性肾上腺增生（PMAH，n = 10），这些样本进一步分为伴有ARMC5致病性变异的PMAH（PMAHw，n = 5）和无ARMC5突变的PMAH（PMAHwt，n = 5）。表1和图S1总结了正常组织和肿瘤碎片患者的临床及组织学特征。表2汇总了ACC和PMAH患者的遗传信息，包括胚系致病性TP53和ARMC5变异，以及ACC的激素产生状态。在PMAHw患者的样本中，检测到了ARMC5基因的胚系变异，包括一个错义变异（患者1）、两个无义变异（患者2和4）、一个剪接位点变异（患者3）和一个移码变异（患者5）。在患者2的样本中观察到了第二类体细胞突变事件，即等位基因丢失（LOH），而在患者3的样本中发现了一个内含子框内缺失。有关PMAH和ARMC5变异的更多信息也可在Cavalcante（2019）的研究中找到。

研究遵循赫尔辛基宣言的伦理原则，并获得了圣保罗大学生物医学研究所和国家研究伦理委员会（CONEP）的批准，编号为6.524.377。所有患者或其法定监护人均提供了书面知情同意。

在进行蛋白质组分析之前，我们对样本进行了详细的准备。首先，将正常肾上腺组织部分解冻后，将其放置在冷冻表面上，并沿着矢状面将其切开。随后，在同一平面切取3 mm厚的切片，以显示正常肾上腺组织的所有区域。使用8 M尿素溶液和5%蛋白酶抑制剂提取总蛋白，并在56°C下孵育30分钟，直到完全溶解。样品经过冰上超声处理三次，每次30秒，超声波强度为40%。蛋白提取物使用Qubit（Thermo Fisher Scientific）进行定量。蛋白消化和肽纯化按照Kawahara等人（2021）的方法进行，但进行了部分修改。提取50微克蛋白，并在30°C下使用10 mM DTT处理45分钟，然后在室温下黑暗环境中用40 mM碘乙酰胺烷基化30分钟。反应通过添加5 mM DTT终止，并将样品稀释至0.8 M尿素浓度。蛋白使用胰蛋白酶（1:50，w/w；Promega）在37°C下过夜消化。样品使用1%三氟乙酸（TFA）酸化以停止胰蛋白酶消化，然后在10,000 rpm下离心10分钟以去除不溶性物质。收集上清液，并使用含有3 M Empore C18盘的Stagetips进行脱盐处理。最后，将肽样品在真空浓缩器（Labconco，美国堪萨斯城）中干燥。

分析使用了液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）技术，该技术通过数据非依赖采集（DIA）模式进行。在DIA模式下，样品在全扫描模式中进行分析，分辨率设为60,000，用于MS1的确定。质量范围设定为350–950 m/z，隔离窗口为10 m/z。全扫描的AGC目标值设为300%，注入时间为50毫秒。对于碎片光谱，AGC目标值设为1000%，注入时间同样为50毫秒。共获取了60个10 Da的窗口以覆盖整个扫描范围。归一化碰撞能量设定为32%和36%。MS/MS光谱使用FAIMS系统中的两个补偿电压（-45 V和-60 V）进行采集，分辨率设为30,000，最大注入时间为50毫秒，质量范围为120到2000 m/z，动态排除时间为45秒。通过这些分析，我们能够全面了解蛋白质组的变化，并为后续的生物信息学分析提供数据支持。

在数据和生物信息学分析方面，我们首先将原始文件转换为mzML格式，使用MSConvert软件（SourceForge Inc.）。蛋白鉴定通过DIANN程序（版本1.9.1）进行，该程序基于从UniProt下载的Homo sapiens数据库。搜索参数包括：使用胰蛋白酶作为酶，允许一次错切；甲硫氨酸氧化作为可变修饰；半胱氨酸的碳酰胺基化作为固定修饰；前体m/z范围为350–950；肽段长度范围为7–30；碎片离子m/z范围为200–1800；前体电荷范围为1–4；前体假发现率（FDR）设为1%。搜索过程中，MS的容差为10 ppm，MS/MS的容差为0.05 Da。蛋白质组数据使用R Studio（版本4.3.3）进行分析。预处理步骤包括数据归一化和缺失值填补。缺失值使用R包“pcaMethods”中的“pca”函数进行填补。对原始数据进行log2变换，并使用“preprocessCore”包中的“normalize.quantiles”函数进行量化归一化。差异表达分析使用R中的“limma”包进行，通过将归一化数据拟合为线性模型并应用经验贝叶斯方法调整标准误差，评估统计显著性。使用Benjamini-Hochberg方法计算调整后的p值以控制假发现率（FDR）。FDR值小于0.05的蛋白质被视为统计学显著。蛋白质注释使用UniProtKB代码（https://www.uniprot.org/）和Gene Ontology AmiGO2（https://amigo.geneontology.org/amigo/landing）进行。蛋白质-蛋白质相互作用网络和功能富集分析使用STRING版本12.0平台（https://string-db.org/）进行，使用高置信度相互作用评分（0.700）、相似性阈值（0.8）和FDR（0.05）进行分析。使用BioRender软件（https://www.biorender.com/）生成总结图，访问时间为2024年9月。质谱蛋白质组学数据已通过ProteomeXchange联盟的PRIDE平台发布，数据集标识符为PXD062822和10.6019/PXD062822。支持信息表格包含研究中生成和引用的所有数据。

为了验证来自USP的ACC蛋白质组数据集的可重复性和一致性，我们使用了来自首尔国立大学医院的独立ACC队列。通过严格的统计协议进行比较分析，结果显示了显著的定量一致性（图6；表S5）。USP的ACC蛋白质组鉴定了7350种蛋白质，而SNUH的ACC研究鉴定了8302种蛋白质，两者之间有4201种蛋白质重叠。仅包括每个队列中至少35%样本中存在的蛋白质，用于进一步分析，共筛选出3024种蛋白质。蛋白质的全球平均相似度为99.8%，表明在不同中心的蛋白质组之间具有高度的一致性。通过Bland-Altman分析，发现蛋白质表达之间的平均差异和显著差异极小（Z-score >1.96），这表明两个队列之间的蛋白质组高度相似。采用改进的四折交叉验证方法，通过结合相关性和稳定性对蛋白质进行排序，以评估数据的稳健性。该方法在数据子集（ACC_SNUH × NHA_USP和ACC_SNUH × ACA_USP）上进行了测试，确认了其在多中心应用中的可靠性。DEP的验证确认了USP与SNUH之间的49种DEP中有37种（75.5%）得到验证，而USP与SNUH之间的112种DEP中有92种（82.1%）被确认。这些结果为后续在mRNA水平上的交叉验证分析提供了坚实的基础。

此外，利用TCGA平台对ACC和正常肾上腺组织的数据进行了分析，以评估所选蛋白质的预后价值。根据TCGA和GTEx项目提供的数据，ACC样本被分为高表达（n = 38）和低表达（n = 38）组，依据中位数RNA-seq表达水平进行分层。统计显著性通过log-rank检验确定，p值小于0.05视为显著。该平台还提供了风险比（HRs），用于评估高表达组与低表达组中事件（死亡或复发）发生的相对风险。HR大于1表示高表达组的预后较差，而HR小于1则表示预后较好。临床分期分析有助于探讨基因表达水平与疾病进展之间的潜在关联。基因表达水平还基于ACC的病理分期（I–IV）进行分析，比较结果通过小提琴图进行可视化，并使用平台内实现的一元方差分析（ANOVA）评估统计显著性。

统计分析使用R版本4.3.3进行。通过Benjamini-Hochberg方法对p值进行校正，以控制假发现率（FDR）。结果以均值±标准差的形式表达，p值小于0.05视为统计显著。

研究结果表明，通过比较正常肾上腺组织与肿瘤样本的蛋白质组特征，我们鉴定了7350种蛋白质，并对其中3976种进行了定量分析。蛋白质-蛋白质相互作用网络和功能富集分析显示了不同样本之间的显著差异。在ACA与NHA的比较中，发现了27种差异表达蛋白（DEPs），其中2种上调蛋白（MT3和RBM3）和25种下调蛋白，包括NEFL、HAAO、SOD3、IGHA2和HDGFL3等。在ACC与NHA的比较中，发现了49种DEPs，其中4种上调蛋白（DEFA3、NUP160、SRRM2和RBM3）和45种下调蛋白，包括SOD3、CNRIP、DNAH1、GAMT、ADIRF和CA3等。通过GEPIA平台对ACC与NHA的蛋白质组数据进行临床相关性分析，发现SRRM2、NUP160和RBM3与较短的总生存期（OS）、无病生存期（DFS）和晚期分期有关（图S2）。

除了RBM3和SOD3，没有其他蛋白质在比较ACA和PMAH与NHA时表现出显著的上调或下调。然而，ACC和PMAH的DEP谱显示出一些相似性，包括CA3和ADIRF的下调以及SRRM2的上调。CA3和ADIRF的下调可能与ACC和PMAH的肿瘤进展有关，而SRRM2的上调可能与肿瘤的生长和侵袭性有关。这些发现为进一步研究这些蛋白质在肾上腺皮质疾病中的作用提供了依据。

在比较ACC和ACA时，发现了一些关键的DEPs，其中PHGDH和FTO在ACC中上调，而CSRP1和ABLIM1在ACC中下调。PHGDH的表达在ACC中高于ACA，表明其可能与ACC的侵袭性相关。FTO的下调与多种癌症中的m6A修饰有关，这可能影响其在ACC中的作用。CSRP1的下调可能表明其在ACC中作为肿瘤抑制基因的作用，而ABLIM1的下调则可能表明其在ACC中的肿瘤抑制功能。这些发现为进一步研究这些蛋白质在肾上腺皮质癌中的作用提供了新的视角。

在比较PMAHwt和PMAHw时，发现了一些关键的DEPs，其中PCP4在PMAHw中上调，而TERT在PMAHw中下调。PCP4的上调可能与PMAH的结节大小有关，而TERT的下调可能与细胞衰老和肿瘤抑制有关。这些发现表明，PCP4和TERT在PMAH中的表达可能与ARMC5突变和结节大小相关。

通过与TCGA数据的交叉验证，我们确认了UBA2等蛋白质在ACC中的上调，并发现其与多种癌症中的SUMO通路相关。这些结果为未来研究SUMO通路在ACC中的作用提供了方向。同时，通过与文献数据的比较，我们验证了包括STMN1、NDRG4和PHGDH在内的多个蛋白质作为ACC的生物标志物和治疗靶点的潜力。这些发现不仅增强了我们对ACC蛋白质组的理解，还为开发新的诊断和治疗策略提供了依据。

尽管本研究提供了重要的蛋白质组信息，但也存在一些局限性。首先，正常和肿瘤组织样本的样本量较小，这可能影响结果的广泛适用性。其次，获取人类肾上腺组织样本存在伦理和实践上的挑战。技术上的局限性包括蛋白质组分析过程中可能存在的细胞残余干扰，以及无法逆转酶促或自发形成的蛋白质交联，这可能影响蛋白质的鉴定。虽然LC–MS/MS能够广泛覆盖蛋白质组，但在不使用特定富集策略的情况下，检测低丰度蛋白质仍然具有挑战性。最后，肾上腺肿瘤的生物学复杂性表明，需要整合多组学方法，包括基因组、转录组和功能分析，以全面理解肾上腺肿瘤的生物学改变。

本研究通过全面的蛋白质组分析，揭示了正常肾上腺组织与肾上腺皮质腺瘤（ACA）、肾上腺皮质癌（ACC）和原发性大结节性肾上腺增生（PMAH）之间的蛋白质组差异。研究结果不仅为肾上腺皮质疾病的分子机制提供了新的见解，还为未来的研究提供了重要的参考数据。通过使用高通量技术，我们能够识别出潜在的生物标志物和治疗靶点，这为肾上腺皮质疾病的诊断和治疗策略提供了新的方向。此外，通过与其他研究的交叉验证，我们确认了蛋白质组数据的可靠性和一致性，为多中心研究提供了重要的基础。未来的研究可以基于这些发现，进一步探索蛋白质组在肾上腺皮质疾病中的作用，以及其在疾病诊断和治疗中的应用潜力。