山羊疱疹病毒1型会降低乳腺癌细胞的存活率，并增强其对化疗药物的敏感性

《Frontiers in Oncology》：Caprine herpes virus-1 reduces cell viability and enhances chemosensitivity in breast cancer cells

溶瘤病毒caprine herpesvirus 1（CpHV-1）在乳腺癌多亚型细胞中显示剂量依赖性细胞毒性，诱导凋亡并抑制克隆形成，同时与靶向药物abemaciclib（HR+/HER2-）、tucatinib（HER2+）和inavolisib（TNBC）协同增效，且对正常MCF-10A细胞无显著毒性。

　　乳腺癌是一种高度异质性的恶性肿瘤，起源于乳腺导管或小叶的上皮细胞。其病因复杂，涉及遗传、激素和环境等多种因素，包括年龄、家族史、BRCA1/2基因突变、激素影响、酒精摄入和肥胖等。根据组织学分类，乳腺癌主要包括侵袭性导管癌（IDC，占病例的70–80%）、侵袭性小叶癌（ILC，占10–15%）以及较少见的特殊类型。这种形态学和分子学上的异质性决定了肿瘤的侵袭性、预后情况以及对治疗的反应差异。从分子机制的角度来看，乳腺癌可分为四种内在亚型：激素受体阳性（Luminal A和Luminal B）、HER2阳性（HER2+）和三阴性乳腺癌（TNBC）。其中，Luminal型肿瘤通常对内分泌治疗（如抗雌激素药物）敏感，常与CDK4/6抑制剂（如阿贝西利）、PI3K抑制剂（如伊纳维利昔）或mTOR抑制剂联合使用。HER2+型肿瘤则受益于靶向HER2的治疗策略，包括单克隆抗体、酪氨酸激酶抑制剂（如图卡替尼）和抗体药物偶联物（ADCs）。而TNBC由于缺乏明确的分子靶点，通常依赖于化疗，近年来免疫检查点抑制剂、新型ADCs和联合治疗策略的应用使该亚型的治疗取得了新的进展。

尽管乳腺癌治疗手段不断进步，但该疾病仍然是女性癌症相关死亡的第二大原因。治疗相关的毒性进一步影响了患者的生活质量，这促使科学家们寻找更具创新性和更低毒性的治疗方案。在这一背景下，溶瘤病毒疗法（OVT）作为一种新兴的抗肿瘤手段，引起了广泛关注。OVT基于基因工程改造或天然存在的病毒，能够选择性地感染并裂解肿瘤细胞，同时避免对正常组织造成伤害。此外，OVT不仅能直接破坏肿瘤细胞，还能将免疫学上“冷”型的肿瘤转化为“热”型，促进免疫细胞浸润和抗肿瘤免疫反应，从而增强免疫治疗的效果。例如，pelareorep（Reolysin）联合紫杉醇在转移性乳腺癌中显示出延长无进展生存期和增强免疫激活的效果，而单独使用则效果有限。T-VEC（一种成熟的溶瘤病毒）在一项II期临床试验中，与新辅助化疗联合使用时，对TNBC患者表现出良好的病理完全缓解率。类似地，脂质体腺病毒载体（Ad-hTERT）在TNBC模型中也显示出增强的递送能力、T细胞浸润和减少转移的潜力。

与人类来源的溶瘤病毒相比，非人类野生型溶瘤病毒具有独特的优势。它们在人类中不具有致病性，并且不会引发预先存在的免疫反应，同时仍能特异性地感染恶性细胞。例如，山羊疱疹病毒1（CpHV-1）是一种DNA病毒，与牛疱疹病毒1（BoHV-1）有亲缘关系，但对人类无致病性。值得注意的是，CpHV-1能够在多种人类癌细胞系中有效复制，包括具有高度侵袭性的TNBC细胞系MDA-MB-468，并通过依赖caspase的凋亡和自噬机制诱导细胞死亡。这种双重细胞死亡机制可能有助于克服其他溶瘤病毒治疗中的耐药性问题。

本研究旨在评估CpHV-1在不同乳腺癌细胞系中的抗肿瘤效果，并探索其与美国食品药品监督管理局（FDA）批准的乳腺癌靶向药物的协同作用。我们选择了四种代表性的乳腺癌细胞系：MCF-7、T47D、SKBR3和MDA-MB-468，以及非肿瘤性的乳腺上皮细胞MCF-10A。CpHV-1的治疗效果在这些细胞系中均表现出剂量依赖性和时间依赖性，且对正常细胞影响较小。此外，CpHV-1还被测试与三种FDA批准的靶向药物联合使用：阿贝西利（用于HR+/HER2?型乳腺癌）、图卡替尼（用于HER2+型乳腺癌）和伊纳维利昔（用于三阴性乳腺癌）。我们通过Chou–Talalay分析方法评估了这些组合的协同效应，并发现CpHV-1与所有三种药物在不同乳腺癌亚型中均表现出显著的协同作用，且对正常细胞无明显毒性。

CpHV-1的抗肿瘤效果主要通过细胞存活率、克隆形成能力和细胞凋亡等机制实现。在细胞存活率实验中，我们使用MTS法检测了不同倍数感染（MOI）下的细胞活力变化。结果显示，在72小时后，MOI为5时，CpHV-1能够使所有乳腺癌细胞系的细胞活力下降约50%。此外，通过克隆形成实验进一步验证了CpHV-1对肿瘤细胞的长期抑制作用，表明其不仅能够短期内减少细胞数量，还能有效阻止细胞的增殖能力。这一发现为CpHV-1在乳腺癌治疗中的应用提供了重要的支持。

为了进一步探讨CpHV-1的抗肿瘤机制，我们评估了其对细胞凋亡的影响。通过Western blot分析，我们观察到CpHV-1感染后，乳腺癌细胞中的PARP蛋白（一种凋亡标志物）发生裂解，而正常细胞MCF-10A则未出现这一变化。这表明CpHV-1能够特异性地诱导乳腺癌细胞的凋亡，而不影响正常细胞。同时，我们还检测了另一种凋亡相关蛋白NOXA的表达水平，发现其在所有乳腺癌细胞系中均显著上调，而正常细胞则未表现出类似变化。此外，通过Annexin V凋亡检测实验，我们进一步确认了CpHV-1在不同乳腺癌亚型中的促凋亡作用。该实验显示，在CpHV-1单独或与靶向药物联合使用的情况下，乳腺癌细胞的凋亡率显著增加，而正常细胞则未受到影响。

CpHV-1还被发现能够干扰乳腺癌细胞的细胞周期进程。我们通过流式细胞术（FACS）分析了CpHV-1感染后细胞周期各阶段的分布情况。结果显示，CpHV-1感染显著增加了S期细胞的比例，同时降低了G0/G1期细胞的比例。这表明CpHV-1可能通过干扰细胞周期调控机制，促进细胞进入分裂期，从而为病毒复制创造更有利的环境。我们进一步检测了pRB2/p130蛋白的表达水平，该蛋白是细胞周期调控中的关键因子。Western blot分析显示，CpHV-1感染后，所有乳腺癌细胞系中的pRB2/p130蛋白水平均显著下降，而正常细胞则未受影响。这一变化可能反映了CpHV-1通过干扰细胞周期调控来增强其抗肿瘤效果。

在评估CpHV-1与靶向药物的协同作用时，我们发现其在不同乳腺癌亚型中均表现出显著的协同效应。通过Chou–Talalay方法计算的组合指数（CI）显示，CI值小于1表明存在协同作用，而所有测试的细胞系均表现出CI值小于1，说明CpHV-1与这些药物的联合使用能够显著增强抗肿瘤效果。此外，我们还检测了这些组合对正常细胞的影响，发现MCF-10A细胞在72小时的治疗后未表现出显著的毒性反应。这表明CpHV-1与靶向药物的联合治疗不仅有效，而且安全性较高，具有良好的临床应用前景。

在讨论部分，我们强调了CpHV-1作为溶瘤病毒在乳腺癌治疗中的潜力。首先，CpHV-1能够显著降低所有测试乳腺癌细胞系的细胞活力和克隆形成能力，这表明其具有广泛的抗肿瘤活性。其次，CpHV-1能够特异性地诱导乳腺癌细胞的凋亡，而对正常细胞无明显影响，这进一步支持了其选择性抗肿瘤作用。此外，CpHV-1通过干扰细胞周期调控，促进了细胞进入分裂期，这可能为病毒复制提供了更有利的条件，从而增强了其抗肿瘤效果。最后，CpHV-1与靶向药物的联合使用表现出良好的协同效应，这表明其可能成为一种有效的新型治疗策略，能够提高乳腺癌患者的治疗反应，同时减少治疗相关的毒性。

尽管本研究提供了重要的证据支持CpHV-1在乳腺癌治疗中的应用潜力，但仍存在一些局限性。例如，我们没有使用复制缺陷型或非溶瘤型的CpHV-1作为内部阴性对照，这可能影响对观察到的细胞毒性效应的因果关系判断。虽然已有类似的研究采用减毒或突变病毒株作为对照（如删除ICP34.5基因的单纯疱疹病毒变种或聚合酶基因突变的病毒），但目前尚未有CpHV-1的此类变种可供使用。因此，我们无法完全排除一些效应可能来源于非复制性病毒成分或病毒进入过程。未来的研究应考虑构建CpHV-1的突变株或非溶瘤型病毒作为对照，以进一步验证其治疗效果的机制。

目前，针对乳腺癌的溶瘤病毒研究主要集中在基因改造或联合治疗策略上。例如，腺病毒是乳腺癌研究中最常被使用的溶瘤病毒之一，特别是在TNBC中，经过基因修饰的腺病毒如CNHK600-IL24在联合治疗中表现出较强的抗肿瘤效果。其他如G47D（基于单纯疱疹病毒）和VG9-IL-24（重组牛痘病毒）也在乳腺癌模型中显示出显著的细胞毒性，但通常需要与其他治疗手段联合使用。最近的一项临床案例中，CHECKvacc（一种基于CF33的痘病毒）在转移性TNBC患者中表现出显著的肿瘤退缩和延长无病生存期的效果，但这一成果是在后续联合使用T-DXd（一种ADC药物）后实现的，凸显了联合治疗策略的重要性。

综上所述，本研究的结果表明，CpHV-1作为一种非人类野生型溶瘤病毒，在乳腺癌治疗中展现出广阔的前景。它不仅能够有效抑制多种乳腺癌亚型的细胞活力和克隆形成能力，还能通过诱导凋亡和干扰细胞周期调控来增强其抗肿瘤效果。此外，CpHV-1与靶向药物的联合使用表现出良好的协同效应，且对正常细胞无明显毒性。这些发现为CpHV-1在乳腺癌治疗中的应用提供了重要的理论支持和实验依据。然而，为了更全面地理解其作用机制，仍需进一步研究，包括构建CpHV-1的突变株作为对照，以及评估其在临床试验中的安全性和有效性。未来的工作应致力于优化CpHV-1的治疗策略，探索其与其他治疗方法的潜在组合，以期为乳腺癌患者提供更有效、更安全的治疗选择。