具核梭菌重编程脂肪细胞通过CCL2-CCR2轴促进头颈癌坏死转移淋巴结的顺铂耐药性

《Cell Communication and Signaling》：Fusobacterium nucleatum-reprogrammed adipocytes promote tumor cisplatin resistance through the CCL2-CCR2 axis in the necrotic metastatic neck nodes of head and neck carcinoma

本研究针对头颈鳞状细胞癌（HNSCC）坏死性转移淋巴结中顺铂耐药机制不清的问题，揭示了具核梭菌（F. nucleatum）通过重编程脂肪细胞，经自分泌/旁分泌CCL2激活CREB/HSL磷酸化促进脂解，并上调SLC1A5和SLC7A11导致谷胱甘肽（GSH）积累，从而诱导顺铂耐药。CCR2拮抗剂RS504393可有效逆转此过程，为克服HNSCC化疗耐药提供了新靶点。

　　

在头颈鳞状细胞癌（HNSCC）的治疗中，一个棘手的临床难题是：即使原发灶对化疗反应良好，颈部转移的淋巴结却常常表现出顽固的耐药性，导致治疗失败和患者预后不佳。此前的研究已经发现，淋巴结内的坏死区域是导致化疗抵抗的关键因素之一，但其背后的具体机制一直笼罩在迷雾之中。与此同时，科学家们注意到，在我们的头颈部区域，存在着一个复杂的微生物生态系统，其中一种名为具核梭菌（Fusobacterium nucleatum, F. nucleatum）的细菌，被发现与HNSCC的不良预后密切相关。另一方面，肿瘤微环境中的脂肪细胞（adipocytes）也被发现在多种癌症中扮演着“帮凶”的角色，它们可以通过为肿瘤细胞提供能量和分泌促进肿瘤生长的因子来助长癌细胞的恶性行为。那么，在HNSCC坏死转移淋巴结这个特殊的战场上，细菌、脂肪细胞和肿瘤细胞之间，是否存在着某种不为人知的“对话”，共同导演了这出化疗耐药的大戏？这正是发表在《Cell Communication and Signaling》上的这项研究试图解答的核心问题。

为了揭示这一谜团，研究人员综合运用了多种关键技术方法。他们首先收集了24例经病理证实为淋巴结转移的HNSCC患者术后组织标本（来自复旦大学附属眼耳鼻喉科医院），通过qPCR（实时定量聚合酶链反应）和DNA原位杂交技术检测组织中具核梭菌的定植情况。利用转录组测序分析了与具核梭菌共培养后脂肪细胞的基因表达谱变化，并通过qPCR、Western blot（蛋白质印迹）和ELISA（酶联免疫吸附测定）等技术在RNA和蛋白水平验证了相关分子的表达。此外，研究还构建了皮下移植瘤小鼠模型进行体内功能验证，并采用CCK-8法检测细胞活力、EdU法检测细胞增殖、流式细胞术检测细胞凋亡/坏死、油红O和BODIPY染色观察脂滴、以及GSH和脂质过氧化检测等细胞功能学实验来阐明机制。

1. F. nucleatum侵入HNSCC坏死转移淋巴结中的脂肪细胞

研究人员发现，与无非坏死转移淋巴结的患者相比，伴有坏死转移淋巴结的HNSCC患者肿瘤表面拭子中的具核梭菌载量显著更高。原位杂交结果进一步证实，具核梭菌在坏死转移淋巴结和原发肿瘤组织中的丰度明显高于非坏死组织。值得注意的是，具核梭菌不仅存在于坏死区域，还侵入了邻近的脂肪组织。在对诱导化疗反应不佳的残留转移淋巴结中，也检测到了具核梭菌侵入周围脂肪细胞的现象。体外实验模拟坏死微环境的缺氧条件，显著增强了具核梭菌对脂肪细胞的感染能力。小鼠体内实验也证实了腹腔注射具核梭菌后可在脂肪组织中定植。这些结果表明，具核梭菌倾向于在坏死转移淋巴结中富集，并能侵入其中的脂肪细胞。

2. F. nucleatum感染的脂肪细胞获得促癌特性

当研究人员将前脂肪细胞和成熟脂肪细胞与不同浓度的具核梭菌共培养时，发现细菌感染显著抑制了前脂肪细胞的生长，并诱导了前脂肪细胞和成熟脂肪细胞的坏死。更重要的是，具核梭菌感染引发了脂肪细胞的“重编程”，表现为细胞内脂滴减少，同时培养上清液中游离脂肪酸（free fatty acid, FFA）的释放增加。此外，脂肪细胞中多种促癌因子，如MMP-11、IL-6、IL-1β、CCL5和CCL2的表达均显著上调。这些变化表明，具核梭菌将脂肪细胞“改造”成了具有癌症相关脂肪细胞（cancer-associated adipocytes, CAAs）特征的细胞，其特点是脂解活性增强并持续分泌促肿瘤因子。

3. F. nucleatum重编程的脂肪细胞加速HNSCC的顺铂耐药

为了探究具核梭菌修饰的脂肪细胞在顺铂耐药中的作用，研究人员构建了小鼠模型。他们将HNSCC细胞（Fadu细胞）分别注射到裸鼠的腹股沟区（脂肪丰富）和背部（脂肪稀少）皮下。结果显示，具核梭菌感染显著促进了肿瘤生长，且腹股沟区肿瘤的体积和质量均大于背部肿瘤，表明具核梭菌在脂肪丰富环境中的促瘤作用更强。体外实验发现，用经具核梭菌处理的脂肪细胞条件培养基培养HNSCC细胞（Fadu和AMC-HN-8细胞）后，细胞对顺铂的半数抑制浓度（IC₅₀）显著升高。机制探索表明，顺铂通常诱导的脂质过氧化（一种重要的抗肿瘤机制）被具核梭菌处理的脂肪细胞条件培养基所削弱，同时细胞内还原性代谢物谷胱甘肽（GSH）的水平显著增加。这说明具核梭菌重编程的脂肪细胞通过提升肿瘤细胞内GSH水平和抑制脂质过氧化，赋予了其顺铂耐药性。

4. F. nucleatum重编程的脂肪细胞通过激活CREB/HSL和分泌CCL2促进肿瘤顺铂耐药

研究人员深入探讨了具核梭菌诱导脂肪细胞重编程的分子途径。他们聚焦于脂肪细胞中两种主要的脂解机制：激素敏感性脂肪酶（hormone-sensitive lipase, HSL）介导的脂解和脂噬（lipophagy）。Western blot结果显示，与具核梭菌共培养显著增强了CREB和HSL的磷酸化水平，同时下调了关键脂噬标志物（如LAMP2和beclin1）的表达，并上调了SQSTM1/p62的表达，而LC3A/B的比例无显著变化。这表明具核梭菌主要激活了经典的CREB/HSL信号通路来促进脂解，而非脂噬途径。转录组测序分析揭示了具核梭菌处理的脂肪细胞基因表达谱发生显著改变，KEGG通路富集分析显示细胞因子-细胞因子受体相互作用通路被显著激活。其中，CCL2的表达上调尤为突出。ELISA检测证实，具核梭菌感染的脂肪细胞分泌的CCL2蛋白量显著增加。进一步的功能实验表明，外源性重组CCL2能够模拟具核梭菌的作用，诱导脂肪细胞脂解和HNSCC细胞顺铂耐药，而中和CCL2的抗体则可以逆转这些效应。综合来看，具核梭菌通过双重机制重编程脂肪细胞：一是通过激活CREB/HSL介导的脂解代谢，为肿瘤提供能量底物；二是通过分泌CCL2进行旁分泌信号传导，营造保护性的肿瘤微环境。

5. CCR2拮抗剂通过下调SLC1A5和SLC7A11逆转具核梭菌重编程脂肪细胞的促癌顺铂耐药效应

鉴于CCR2是CCL2的主要受体，研究人员探究了阻断CCR2能否逆转具核梭菌诱导的顺铂耐药。他们在具核梭菌感染的小鼠模型中，联合使用CCR2拮抗剂RS504393和顺铂。结果发现，与单用顺铂相比，联合治疗显著降低了肿瘤体积和质量，证明了CCR2阻断的抗耐药效果。体外实验显示，RS504393能以剂量依赖的方式抑制Fadu细胞的增殖，尤其是在用经具核梭菌处理的脂肪细胞条件培养基培养时效果最明显，并且能显著降低此种条件下HNSCC细胞对顺铂的IC₅₀。此外，RS504393处理还部分逆转了具核梭菌诱导的脂肪细胞内脂滴减少和上清液中游离脂肪酸增加的现象，并降低了CREB和HSL的磷酸化水平。这表明CCR2拮抗剂不仅靶向了CCL2对肿瘤细胞的旁分泌作用，也影响了其对脂肪细胞脂解的自分泌刺激。为了阐明CCR2阻断影响顺铂耐药的下游机制，研究人员发现RS504393处理有效逆转了由具核梭菌重编程脂肪细胞诱导的氧化还原失衡，恢复了脂质过氧化水平，并减少了过度的细胞内GSH积累。由于GSH稳态与谷氨酰胺代谢紧密相关，他们进一步检测发现，具核梭菌处理的脂肪细胞条件培养基能显著上调HNSCC细胞中谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5和SLC7A11的mRNA和蛋白表达，而RS504393处理则能有效抵消这种代谢重编程。这些发现勾勒出一条完整的信号通路：具核梭菌重编程的脂肪细胞通过激活CCL2/CCR2轴，上调谷氨酰胺转运蛋白，从而增强GSH合成并赋予顺铂耐药性，而这一过程可通过CCR2抑制进行靶向治疗。

本研究首次揭示了具核梭菌在HNSCC微环境中塑造癌症相关脂肪细胞的关键作用。研究结论表明，在HNSCC坏死转移淋巴结的特殊微环境下，具核梭菌能够侵入并重编程脂肪细胞，使其获得促癌特性。这一重编程过程主要通过激活CREB/HSL通路增强脂解，以及大量分泌CCL2来实现。旁分泌的CCL2通过与其受体CCR2结合，上调肿瘤细胞中的谷氨酰胺转运蛋白SLC1A5和SLC7A11，进而促进谷胱甘肽（GSH）的合成，帮助肿瘤细胞抵抗顺铂诱导的氧化应激和脂质过氧化损伤，最终导致化疗耐药。讨论部分强调了这一发现的创新性，它将微生物感染、脂肪细胞代谢重编程和肿瘤化疗耐药这三个看似独立的领域巧妙地联系起来。研究人员指出，淋巴结坏死造成的缺氧环境可能为具核梭菌的富集提供了有利条件，而循环肿瘤细胞（CTCs）则可能作为细菌传播的载体。该研究不仅深化了对肿瘤微环境中微生物-宿主细胞相互作用的理解，更重要的是，它揭示了靶向CCL2-CCR2轴（例如使用RS504393）作为一种潜在的新型治疗策略，用于克服由具核梭菌相关脂肪细胞驱动的HNSCC顺铂耐药，为改善患者预后带来了新的希望。