工程化NLRs：植物广谱抗病性的新范式

《Molecular Horticulture》：Expanding disease resistance: engineered NLRS for broad-spectrum protection

本刊推荐：为克服NLRs（核苷酸结合富亮氨酸重复序列蛋白）介导的抗性谱窄、病原体易逃逸等局限，Wang团队创新性地提出基于病毒蛋白酶切割位点的NLR工程策略。研究通过将马铃薯Y病毒NIa蛋白酶切割位点融合至自激活Tm-2°及NRG1.1，成功在烟草及大豆中实现对多种马铃薯Y病毒科病毒的广谱抗性。该策略突破传统"基因对基因"模式，为作物抗病育种提供新路径。

　　

在植物与病原体漫长的协同进化过程中，作物病害每年造成全球农作物产量损失高达20%-30%。植物依靠两层免疫系统抵御入侵：由模式识别受体（PRRs）介导的模式触发免疫（PTI）构成第一道防线，而效应子触发免疫（ETI）则通过NB-LRR蛋白（NLRs）特异性识别病原体效应子，引发更强烈的免疫反应。尽管NLR基因的应用已成为作物抗病育种的核心策略，但其固有局限性始终难以突破：单个NLR通常仅识别特定效应子，导致抗性谱狭窄；而通过定向突变或结构域重排等工程手段扩展识别范围时，又受限于作物物种中缺乏兼容的NLR蛋白。

为解决这一难题，上海交通大学农业与生物学院王云静团队在《Molecular Horticulture》发表突破性研究，提出一种颠覆性的NLR工程策略。该研究巧妙利用病毒蛋白酶对特定切割位点的识别特性，将病原体毒力因子转化为激活植物免疫的"分子开关"，为作物广谱抗病育种开辟了新维度。

关键技术方法

研究通过农杆菌介导的转基因技术，在本氏烟及大豆中表达融合病毒蛋白酶切割位点的自激活NLRs（aTm-2^°/aAtNRG1.1）。利用免疫印迹验证蛋白酶切割效率，通过病毒接种实验评估对马铃薯Y病毒（PVY）、芜菁花叶病毒（TuMV）等5种马铃薯Y病毒科病毒的抗性。进一步设计串联切割位点构建双识别系统，并借助基因组编辑技术验证该策略在作物中的适用性。

研究结果

1. 蛋白酶切割激活CNL/RNL的分子机制

研究团队发现CNL/RNL的活性依赖于游离N末端，而N末端多肽标签会抑制其功能。基于这一特性，他们选取马铃薯Y病毒科高度保守的NIa蛋白酶（识别xxVxxQ↓A(G/S)基序），将PVY特异性切割位点融合至自激活Tm-2^°的N末端，构建HA-PCS^PVY-aTm-2^°嵌合蛋白。免疫印迹证实NIa-Pro^PVY可特异性切割该标签，释放具有活性的Tm-2^°。

2. 工程化NLRs赋予广谱抗病毒能力

转基因本氏烟实验显示，表达HA-PCS^PVY-aTm-2^°的T1代植株对PVY、TuMV、辣椒斑驳病毒（PepMoV）等5种病毒均表现完全抗性。进一步将策略扩展至RNL家族，构建HA-PCS^PVY-aAtNRG1.1和HA-PCS^PVY-aNbNRG1，发现修饰后的RNLs同样可介导对多种马铃薯Y病毒科病毒的极端抗性。

3. 串联切割位点突破识别局限

针对烟草蚀纹病毒（TEV）NIa蛋白酶识别基序（xxVxHQ↓A(G/S)）的差异，研究团队开发了串联切割位点构建体HA-PCS^TEV-PCS^PVY-aAtNRG1.1。该双识别系统不仅保持对原有5种病毒的抗性，还对TEV产生部分至完全抗性，显著拓宽了防护范围。

4. 作物应用验证策略普适性

在大豆模型中构建HA-PCS^SMV-aAtNRG1.1（SMV为大豆花叶病毒），转基因大豆植株对SMV表现完全抗性。这一成功转化证实该策略在重要经济作物中具有应用潜力。

结论与展望

本研究突破传统NLR工程依赖效应子特异性识别的局限，开创了"病原体蛋白酶激活型免疫开关"新范式。相较于RPS5-PBS1守护系统或Pik-1/Pik-2结构域重排等现有技术，该策略具有三大优势：其一，通过靶向保守蛋白酶避免繁琐的诱饵筛选；其二，兼容CRISPR基编辑等前沿技术，可实现内源NLRs的精准调控；其三，抗性具有持久性，因为病原体蛋白酶功能缺失将导致致命性适应代价。

该策略的跨物种适用性暗示植物免疫下游信号通路具有保守性。正如Du等研究发现，将茄科传感器NLRs与辅助NRCs共表达可在水稻、拟南芥中重建免疫功能，本研究设计的aNLRs可能通过产生通用"细胞死亡信号"被不同物种保守通路放大。未来通过人工智能辅助挖掘真菌、卵菌等病原体的保守蛋白酶基序，有望建立NLR免疫的通用激活密码。此外，该模块化设计可扩展至泛素化修饰等其它病原体酶促反应系统，实现更广泛的免疫调控。

尽管该体系对缺乏PCSs的病原体无效，且可能存在脱靶风险，但其通过劫持病原体核心毒力因子触发免疫的创新思路，为作物抗病育种提供了颠覆性解决方案。随着基因组编辑技术与蛋白设计平台的深度融合，这种"以子之矛，攻子之盾"的策略有望成为未来智能作物设计的重要支柱。