SIRT5通过调控BMP2琥珀酰化促进BMSCs成骨分化及胫骨骨折愈合的作用与机制研究

《Stem Cell Research & Therapy》：SIRT5-mediated regulation of BMP2 succinylation enhances osteogenic differentiation of BMSCs and promotes tibial fracture healing

本研究针对骨折愈合过程中骨形态发生蛋白2(BMP2)稳定性差、成骨诱导效能受限的临床难题，揭示了去琥珀酰化酶SIRT5通过直接作用于BMP2蛋白的Lys-272位点，降低其琥珀酰化修饰水平，显著增强BMP2稳定性及转录活性，进而促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨分化并加速大鼠胫骨骨折愈合。该发现为靶向SIRT5-BMP2轴治疗骨不连、骨质疏松性骨折等骨骼疾病提供了新策略。

　　

骨骼，作为支撑人体的重要结构，其损伤后的自我修复能力虽然强大，但面对严重创伤、老年骨质疏松或糖尿病等慢性疾病时，骨折愈合过程常常变得缓慢甚至停滞，形成骨不连，给患者带来长期痛苦和功能障碍。在这一复杂的修复交响曲中，骨髓间充质干细胞(BMSCs)扮演着“种子细胞”的核心角色。它们能够迁移到损伤部位，并分化成骨细胞，源源不断地合成新的骨基质，如同修复工地上最勤奋的建筑工人。然而，如何有效激励这些“种子细胞”高效地工作，即促进其向成骨细胞分化，是加速骨折愈合的关键科学问题。

已知的“激励信号”中，骨形态发生蛋白2(BMP2)是效力最强的一种。它像一把精准的钥匙，能够启动BMSCs内部的成骨基因程序。遗憾的是，这把“钥匙”在体内过于脆弱，容易被快速降解，半衰期短，导致其促进骨再生的效果大打折扣，也限制了其临床应用。因此，寻找能够稳定BMP2、延长其作用时间的“保护盾”，成为该领域的研究热点。

近年来，蛋白质翻译后修饰研究揭示了细胞生命活动的精细调控层。琥珀酰化，作为一种新兴的赖氨酸修饰，被发现能够像开关一样影响蛋白质的功能和命运。而去琥珀酰化酶SIRT5，则负责关闭这个“开关”，即去除琥珀酰化修饰。那么，SIRT5是否能够通过调控BMP2的琥珀酰化状态，来充当其“保护盾”，从而影响BMSCs的成骨分化和骨折愈合呢？这项发表在《Stem Cell Research & Therapy》上的研究，正是围绕这一新颖的科学假说展开的。

为了探索SIRT5在BMSCs成骨分化中的作用，研究人员首先确认了BMSCs的多向分化潜能（包括成骨和成脂分化）及其典型的表面标志物（CD105、CD73、CD90阳性，CD45、CD34阴性）。他们采用慢病毒转染技术构建了SIRT5基因敲低和过表达的BMSCs模型，并通过碱性磷酸酶(ALP)染色、阿尔新红(ARS)染色、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白质印迹(Western blot)等技术评估成骨分化水平。在机制层面，他们运用免疫共沉淀(co-IP)、位点特异性突变、蛋白质稳定性检测（环己酰亚胺CHX追踪）以及双荧光素酶报告基因实验等方法，深入探究了SIRT5对BMP2琥珀酰化、稳定性和转录活性的调控。最后，他们在大鼠胫骨骨折模型中，通过局部注射携带SIRT5过表达和/或BMP2敲低慢病毒，并结合Micro-CT扫描和组织学分析（如HE染色），验证了SIRT5-BMP2轴在体骨折愈合过程中的关键作用。

SIRT5表达与成骨分化正相关

研究人员发现，在BMSCs的成骨诱导过程中，随着诱导时间的延长，代表早期成骨分化的ALP活性和代表晚期矿化的ARS染色结节均显著增加。与此同时，SIRT5在mRNA和蛋白水平的表达量也呈现出时间依赖性的上调趋势。这表明SIRT5的表达与BMSCs的成骨分化进程存在内在关联，提示SIRT5可能积极参与了这一过程。

SIRT5正向调控BMSCs成骨分化

为了明确SIRT5的功能，研究团队通过基因操作改变其表达水平。结果清晰地显示，过表达SIRT5能够显著增强BMSCs的细胞活力、ALP活性、基质矿化能力，并上调关键成骨标志基因（如骨桥蛋白(OPN)、runt相关转录因子2(RUNX2)、成骨细胞特异性转录因子(OSX)和BMP2）的表达。相反，敲低SIRT5则得到完全相反的效果，严重抑制了BMSCs的成骨分化潜能。这充分证明SIRT5是BMSCs成骨分化的一个强有力的促进因子。

SIRT5通过去琥珀酰化稳定BMP2蛋白

机制探索是本研究最精彩的部分。研究人员首先发现SIRT5能够调控全局蛋白质的琥珀酰化水平。更重要的是，通过免疫共沉淀实验，他们证实SIRT5与BMP2蛋白之间存在直接的物理相互作用。进一步分析显示，敲低SIRT5会显著增加BMP2的琥珀酰化修饰水平，并加速其降解，而过表达SIRT5则能降低BMP2的琥珀酰化水平，延长其半衰期，从而增强BMP2的稳定性。为了精确定位SIRT5的作用位点，他们利用生物信息学工具预测出BMP2蛋白上两个潜在的琥珀酰化位点（Lys-272和Lys-297），并通过位点突变实验（将赖氨酸突变为精氨酸K272R/K297R以模拟去琥珀酰化状态）进行功能验证。结果发现，K272R突变能显著提高BMP2的蛋白丰度并降低其琥珀酰化，而K297R突变则效果相反。这表明Lys-272是SIRT5调控BMP2稳定性的关键位点。后续的挽救实验表明，即使在没有SIRT5的情况下，模拟去琥珀酰化的BMP2-K272R突变体也能恢复被SIRT5敲低所抑制的成骨分化能力。双荧光素酶报告基因实验还提示SIRT5可能同时增强了BMP2的转录活性。

BMP2过表达逆转SIRT5敲低导致的成骨分化抑制

为了确认SIRT5的作用主要是通过BMP2介导的，研究人员在敲低SIRT5的BMSCs中同时过表达BMP2。结果显示，BMP2的过表达能够有效挽救因SIRT5缺失而导致的细胞活力下降、ALP活性降低、矿化结节减少以及成骨标志基因表达下调等负面表型。这一结果强有力地证明，BMP2是SIRT5下游执行成骨促进功能的关键效应分子。

SIRT5通过BMP2促进大鼠胫骨骨折愈合

动物体内实验的结果与细胞水平高度一致。在大鼠胫骨骨折模型中，局部过表达SIRT5能显著改善骨折愈合质量，表现为Micro-CT扫描下的骨体积分数(BV/TV)、骨小梁数量(Tb.N)和骨小梁厚度(Tb.Th)增加，骨小梁分离度(Tb.Sp)减小。组织学观察也显示骨痂生成更佳。然而，当同时敲低BMP2时，SIRT5过表达带来的这些有益效应被明显削弱或抵消。此外，SIRT5过表达还降低了血清中的促炎因子（IL-6, TNF-α）水平，提高了促进生长的胰岛素样生长因子1(IGF-1)水平，这些系统性改善也被BMP2敲低部分逆转。骨折局部组织的蛋白分析进一步证实，SIRT5对成骨标志物的上调作用依赖于BMP2的存在。

综上所述，本研究得出了一个清晰的结论：去琥珀酰化酶SIRT5能够与成骨关键因子BMP2直接结合，并通过去除其第272位赖氨酸上的琥珀酰化修饰，显著增强BMP2的稳定性和生物活性，进而强力驱动骨髓间充质干细胞(BMSCs)的成骨分化程序，最终在大鼠体内有效促进胫骨骨折的愈合。

这项研究的重大意义在于，它首次揭示了SIRT5介导的BMP2去琥珀酰化修饰是调控成骨分化和骨折愈合的一个新颖且关键的分子机制。这不仅深化了我们对骨骼生物学中蛋白质翻译后修饰作用的理解，更重要的是，它将SIRT5推向了舞台中央，使其成为一个极具潜力的治疗靶点。未来，通过开发SIRT5激动剂或模拟BMP2去琥珀酰化状态的稳定型BMP2变体，有望为临床治疗骨折延迟愈合、骨不连乃至骨质疏松等骨骼疾病提供比现有BMP2蛋白疗法更优的新策略。此外，研究也提示需要注意SIRT5功能的年龄依赖性差异，为未来精准骨再生医学的研究指明了方向。