综述：利用基因编辑技术增强CAR-T细胞治疗实体瘤的潜力

《Inflammation and Regeneration》：Harnessing the potential of gene editing technology for CAR-T cell therapy of solid tumors

本综述系统阐述了如何运用基因编辑技术（特别是CRISPR/Cas9及其衍生工具）解决嵌合抗原受体T细胞（CAR-T）疗法在实体瘤治疗中面临的瓶颈问题，包括肿瘤微环境（TME）的免疫抑制、CAR-T细胞归巢与浸润困难、抗原异质性以及安全性风险（如细胞因子释放综合征CRS和神经毒性ICANS）。文章重点探讨了基因编辑在生成患者拟似器官样模型、开发通用型（off-the-shelf）CAR-T产品、消除T细胞负向调控因子（如PD-1、TGF-βRII）、表观遗传重编程及CRISPR筛选等方面的创新应用，为提升CAR-T疗法对实体瘤的疗效和安全性提供了全面视角。

　　

引言

CAR-T细胞疗法在血液恶性肿瘤治疗中取得了显著成功，已有多种产品获得FDA批准。然而，其在实体瘤治疗中的效果仍不尽如人意。这主要归因于实体瘤特有的挑战，包括抗原异质性和靶点特异性不足、免疫抑制性肿瘤微环境（TME）、CAR-T细胞归巢和浸润效率低、以及潜在的安全性风险（如on-target off-tumor毒性）。基因编辑技术，尤其是CRISPR/Cas9系统及其新型衍生工具，为克服这些障碍提供了强大的手段。它能够精确地敲除、敲入、激活或抑制特定基因，甚至进行多位点编辑，从而优化CAR-T细胞的功能。

实体瘤CAR-T细胞疗法的当前瓶颈

实体瘤为CAR-T细胞的有效应用设置了多重障碍。理想的靶抗原（如肿瘤特异性抗原TSAs）稀少，迫使疗法大多依赖肿瘤相关抗原（TAAs），而这些抗原在正常组织中也有表达，增加了on-target off-tumor毒性的风险。实体瘤内部抗原表达呈现高度异质性，且治疗过程中易出现抗原丢失变异，导致耐药和复发。

TME是一个复杂的 immunosuppressive 网络，包含肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、调节性T细胞（Tregs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）以及抑制性细胞因子（如TGF-β、IL-10）。这些因素共同削弱CAR-T细胞的增殖和杀伤功能，并促进其衰竭。衰竭的CAR-T细胞表现出效应功能下降、抑制性受体（如PD-1、LAG-3、TIM-3）表达上调以及增殖能力减弱。物理屏障，如致密的细胞外基质（ECM）和异常的肿瘤血管系统，也严重阻碍了CAR-T细胞向肿瘤部位的浸润。

基因编辑技术概述

基因编辑的核心是在特定基因组位点引入DNA双链断裂（DSB），从而利用细胞自身的修复机制（主要是易出错的非同源末端连接NHEJ或需要模板的同源定向修复HDR）实现基因敲除或精确插入。从早期的归巢核酸内切酶（MNs）、锌指核酸酶（ZFNs）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），到革命性的CRISPR/Cas9系统，基因编辑工具的精确性、效率和易用性不断提升。CRISPR/Cas9通过向导RNA（gRNA）将Cas9核酸酶引导至目标DNA序列，并在原间隔序列邻近基序（PAM）附近切割。新型的基因编辑工具，如碱基编辑器（Base Editors）和先导编辑器（Prime Editors），能够在不引起DSB的情况下实现单碱基转换或小片段插入/缺失，显著降低了基因毒性风险。CRISPR激活（CRISPRa）和CRISPR干扰（CRISPRi）系统则能靶向调控基因表达而不改变DNA序列。第三代编辑工具，如CRISPR相关转座酶（CAST）和基于丝氨酸整合酶的系统（如PASTE、PASSIGE），实现了大片段DNA的无DSB靶向整合，进一步提高了安全性和效率。

基因编辑在实体瘤CAR-T细胞疗法中的应用

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  生成患者拟似器官样模型用于更准确的临床前评估
  肿瘤来源的器官样模型（TDOs）能够保留原发肿瘤的遗传、表型和微环境特征，为CAR-T细胞的临床前评估提供了比传统2D培养和动物模型更可靠的平台。基因编辑技术可以进一步优化TDOs，例如通过引入特定致癌突变或构建CRISPR筛选文库，用以研究CAR-T细胞与TME的相互作用、鉴定耐药机制以及预测on-target off-tumor毒性。
  
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  安全性增强
  随机病毒整合CAR转基因存在插入突变激活癌基因的风险。基因编辑可通过HDR将CAR精确整合到基因组安全港（如TRAC、AAVS1位点），实现可控、稳定的表达，同时避免破坏重要基因。为控制潜在毒性，可引入安全开关（如诱导型 caspase 9 iCasp9），或在CAR-T细胞中敲除促炎因子基因（如CSF2/GM-CSF）或使其自主分泌炎症因子抑制剂（如抗IL-6受体单链抗体），以减轻CRS和ICANS。
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  通用型异体CAR-T细胞疗法
  利用基因编辑技术，可以健康供者来源的T细胞开发“off-the-shelf”CAR-T产品。通过敲除T细胞受体（TCR）α恒定区（TRAC）基因来消除TCR，可防止移植物抗宿主病（GvHD）。同时，敲除β₂-微球蛋白（B2M）或CIITA等基因以降低人类白细胞抗原（HLA-I/II）表达，可减少宿主免疫排斥。还可进一步工程化改造，使CAR-T细胞表达NK细胞抑制性配体（如HLA-E、CD47）或敲除NK细胞激活配体，以逃逸宿主NK细胞的攻击。
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  消除T细胞负向调控因子
  免疫检查点分子（如PD-1、CTLA-4、LAG-3、TIM-3）的上调是CAR-T细胞衰竭的关键因素。利用CRISPR/Cas9敲除PD-1等基因，可增强CAR-T细胞在免疫抑制性TME中的功能和持久性。然而，PD-1的完全缺失可能影响T细胞的终末分化和长期持久性，需谨慎评估。此外，敲除其他负调控基因，如FAS（诱导凋亡）、腺苷A_2A受体（A2AR）、CISH、TGF-βRII等，也被证明能增强CAR-T细胞的抗肿瘤活性。
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  提高归巢能力和肿瘤浸润
  实体瘤异常的趋化因子模式和物理屏障限制了CAR-T细胞的浸润。通过基因编辑使CAR-T细胞表达特定的趋化因子受体（如CXCR2靶向IL-8，CCR4靶向CCL17/22），可改善其向肿瘤部位的趋化。表达ECM降解酶（如乙酰肝素酶）或靶向肿瘤基质成分（如癌症相关成纤维细胞CASCs表达的成纤维细胞活化蛋白FAP，或血管内皮生长因子受体2VEGFR2）的CAR，有助于突破物理屏障。CRISPR筛选还发现了ST3GAL1等负向调控CAR-T细胞迁移的基因，为改善浸润提供了新靶点。
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  表观遗传修饰
  CAR-T细胞的效力与其表观遗传状态密切相关。CRISPRa和CRISPRi等工具能够靶向激活或抑制特定基因的转录而不改变DNA序列，为重编程CAR-T细胞命运、延缓衰竭和增强记忆样特征提供了新策略。例如，使用dCas9-KRAB系统在抗原刺激下抑制PD-1表达，或通过全基因组表观遗传筛选识别影响CAR-T细胞功能的关键调控因子。
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  CRISPR筛选
  利用全基因组或靶向CRISPR筛选（包括敲除KO、激活a和干扰i筛选），可以在CAR-T细胞或肿瘤细胞中系统性鉴定影响CAR-T细胞功能、持久性、耐药性的关键基因。例如，筛选发现MED12、CCNC、TLE4、IKZF2等基因的敲除能增强CAR-T细胞的增殖和效应功能。类似地，在肿瘤细胞中进行筛选可揭示其抵抗CAR-T细胞杀伤的机制。新兴的技术如CLASH系统和ModPoKI平台，实现了CAR转基因与CRISPR组件的协同整合和高通量功能筛选，加速了最优CAR结构的发现。

正在进行的临床试验

多项早期临床试验正在评估基因编辑CAR-T细胞在实体瘤中的安全性和初步疗效。例如，靶向间皮素（MSLN）且敲除PD-1的CAR-T细胞（NCT03545815, NCT03747965）在晚期实体瘤患者中显示出可接受的安全性和一定的疾病稳定效果。靶向CD70的通用型CAR-T产品CTX130（敲除TRAC、B2M和CD70）在肾细胞癌中诱导了持久的完全缓解。靶向MUC1或MUC1-C并敲除PD-1或TRBC/B2M的CAR-T细胞也在乳腺癌、非小细胞肺癌等实体瘤的临床试验中进行探索（NCT05812326, NCT03525782, NCT05239143），初步结果显示良好的耐受性。

挑战与考量

基因编辑技术的应用仍面临基因毒性风险，主要是脱靶效应和DSB引起的染色体异常。采用高保真Cas变体、化学修饰gRNA、以及碱基编辑/先导编辑等无DSB技术有助于缓解这些问题。严格的质量控制，包括下一代测序（NGS）、核型分析等，对于评估编辑效率和脱靶效应至关重要。此外，确保足够的编辑效率、富集成功编辑的细胞，以及整合安全开关，都是临床转化中需要解决的关键问题。

结论

基因编辑技术正在深刻改变CAR-T细胞疗法的格局，为攻克实体瘤治疗难题提供了前所未有的机遇。通过精确操控CAR-T细胞的基因组和表观基因组，能够显著增强其安全性、疗效和适用性。未来，结合新型基因编辑工具（如碱基编辑器、先导编辑器）、表观遗传重编程、合理的联合靶点策略以及与其他疗法的联用，将进一步释放CAR-T细胞治疗实体瘤的潜力。长期的安全性监测和持续的临床试验验证将是推动这些创新疗法走向临床的关键。