GSTK1通过PGAM5/DRP1复合物介导的线粒体质量控制调控L-肉碱代谢抑制肝癌恶化

《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》：GSTK1 suppresses HCC aggravation via L-carnitine metabolism by PGAM5/DRP1 complex-mediated mitochondrial quality control

本研究针对肝癌高复发率及治疗策略有限的临床难题，揭示了线粒体蛋白GSTK1在肝癌中的抑癌作用。研究人员通过体内外实验证实，GSTK1通过竞争性结合PGAM5，抑制DRP1介导的线粒体分裂，进而调控线粒体质量控制和L-肉碱代谢，最终抑制肝癌进展。该研究不仅阐明了GSTK1-PGAM5-DRP1轴在肝癌中的新机制，还发现RXRα激动剂Bexarotene和L-肉碱补充剂可作为潜在治疗策略，为肝癌代谢治疗提供了新靶点。

　　

肝癌，尤其是肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC），是全球癌症相关死亡的主要原因之一，其高复发率和有限的治疗选择一直是临床面临的巨大挑战。肝癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程，涉及遗传、表观遗传和环境因素的相互作用。近年来，随着生活方式和饮食结构的改变，由非酒精性脂肪性肝炎（NASH），现也称为代谢功能障碍相关脂肪性肝炎（MASH）所驱动的肝癌发病率呈显著上升趋势，这使得针对代谢途径的治疗策略成为研究热点。癌症，包括肝癌，已被广泛认为是一种代谢性疾病，肿瘤细胞通过重编程其代谢通路，如碳水化合物、氨基酸、脂肪酸和脂质代谢，来满足其快速增殖和生存的需求。然而，过去十年中，靶向癌症代谢的疗法开发进展缓慢，仅有少数药物进入临床试验或获批。在这个过程中，肉碱系统（Carnitine System, CS）及其关键酶，如肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A），作为调控癌细胞代谢可塑性的关键节点，显示出巨大的治疗潜力。肉碱代谢主要发生在线粒体内，而线粒体作为细胞的能量工厂、生物合成中心和信号枢纽，其功能稳态至关重要。为了维持线粒体健康，细胞演化出了一套精细的线粒体质量控制（Mitochondrial Quality Control, MQC）系统，主要包括线粒体生物合成、线粒体动力学（融合与分裂）和线粒体自噬（Mitophagy）。在癌症中，这些过程常常失调，例如，癌细胞通常表现出碎片化的线粒体，这与线粒体分裂蛋白DRP1的激活和融合蛋白MFN2的下调有关，并且与不良预后相关。然而，MQC在肝癌中的具体调控机制及其与代谢重编程的关系仍不完全清楚。

谷胱甘肽S-转移酶Kappa 1（Glutathione S-Transferase Kappa 1, GSTK1），也称为二硫键A氧化还原酶样蛋白（DsbA-L），是一个特异性定位于线粒体和过氧化物酶体的蛋白。此前的研究表明，GSTK1在脂肪因子的分泌、胰岛素抵抗以及非酒精性脂肪肝的进展中发挥作用，但它在肝癌中的具体功能还是一个未知的领域。发表在《Journal of Experimental & Clinical Cancer Research》上的这项研究，旨在揭示GSTK1在肝癌进展中的角色及其分子机制，为开发新的肝癌治疗策略提供理论依据。

为了回答上述问题，研究人员综合运用了多种关键技术方法。在体内研究中，他们构建了肝细胞特异性Gstk1基因敲除（Gstk1^△Hep）小鼠，并利用二乙基亚硝胺（DEN）/四氯化碳（CCl₄）以及DEN/高脂高果糖高胆固醇饮食（HFFCD）两种小鼠模型来模拟化学诱导和MASH驱动的肝癌发生。在体外实验中，他们通过在多种人肝癌细胞系（如HepG2, Hep3B, HCC-LM3, Huh7）中过表达或敲低GSTK1，评估其对肿瘤细胞增殖、迁移、凋亡和能量代谢的影响。分子机制探索方面，研究采用了非靶向代谢组学分析和RNA测序（RNA-seq）来筛选GSTK1调控的关键代谢物和信号通路。通过透射电子显微镜（TEM）观察线粒体超微结构，利用免疫印迹（Western Blot）、免疫荧光（IF）、免疫组织化学（IHC）和免疫共沉淀（Co-IP）结合液相色谱-高分辨质谱（LC-MS/MS）等技术，深入解析了GSTK1对MQC的调控及其与PGAM5/DRP1复合物的相互作用。此外，研究还涉及了临床样本分析（来自南京大学医学院附属鼓楼医院的肝癌及癌旁组织队列）和生物信息学数据分析（利用GEO数据库中的GSE14520和HCCDB8数据集进行预后分析）。

结果

1. 肝细胞Gstk1缺失促进HCC进展

研究人员首先成功构建了肝细胞特异性Gstk1敲除小鼠（Gstk1^△Hep）。在DEN/CCl₄和DEN/HFFCD诱导的肝癌模型中，与对照组（Gstk1^F/F或野生型）相比，Gstk1^△Hep小鼠表现出更严重的肝癌表型：肝脏重量/体重比、最大肿瘤直径和肿瘤负荷均显著增加；血清谷丙转氨酶（ALT）和谷草转氨酶（AST）水平升高，提示肝功能损伤更严重；肝癌标志物（如甲胎蛋白Afp、磷脂酰肌醇蛋白聚糖3Gpc3、纤维蛋白原α链Fga）的mRNA表达水平上调；组织切片中增殖细胞核抗原（PCNA）和Ki67的阳性染色面积增加，表明细胞增殖更为活跃。这些结果证实，肝细胞中GSTK1的缺失显著增强了小鼠对化学诱导和MASH驱动型肝癌的易感性，并促进了肿瘤细胞的增殖。

2. GSTK1抑制HCC细胞系的增殖和迁移

在体外细胞实验中，在HepG2和Hep3B细胞中过表达GSTK1，或在HCC-LM3和Huh7细胞中敲低GSTK1。功能实验表明，GSTK1过表达显著抑制了肝癌细胞的克隆形成能力、EdU掺入所显示的DNA合成活性以及CCK-8检测的细胞活力，同时促进了细胞凋亡。相反，GSTK1敲低则增强了细胞的增殖能力和抗凋亡能力。划痕愈合实验和Transwell小室迁移实验结果显示，GSTK1过表达减少了细胞的迁移能力，而敲低GSTK1则增强了迁移。此外，GSTK1过表达降低了细胞的ATP产量，而敲低则增加了ATP产量。在BALB/c裸鼠皮下移植瘤模型中，过表达GSTK1导致肿瘤体积和重量显著减小，而敲低GSTK1则导致肿瘤生长加速。这些结果一致表明，GSTK1在体外和体内均能有效抑制肝癌的恶性进展。

3. GSTK1负责L-肉碱代谢且L-肉碱对HCC细胞具有抑制作用，该作用可被GSTK1增强

为了探究GSTK1的作用机制，研究人员对小鼠模型进行了非靶向代谢组学分析，发现Gstk1^△Hep小鼠肝脏中的L-肉碱水平显著降低。L-肉碱在脂肪酸氧化供能中起关键作用，但其在肿瘤中的作用存在争议。本研究首次发现，L-肉碱能以浓度依赖的方式抑制肝癌细胞（HepG2, Hep3B）和正常肝细胞（HepRG）的活力，并诱导细胞凋亡，其半数抑制浓度（IC₅₀）在64-116 mM之间。进一步的机制探索显示，L-肉碱处理能诱导肝癌细胞内活性氧（ROS）水平升高，并导致线粒体功能相关基因表达紊乱。重要的是，GSTK1过表达增强了L-肉碱对肝癌细胞的杀伤作用，而GSTK1敲低则削弱了这种作用。在裸鼠模型中，补充L-肉碱能抑制肿瘤生长，且这种抑制效应在GSTK1过表达的肿瘤中更为明显。这表明GSTK1通过调控L-肉碱代谢环境，增强了L-肉碱的抗肿瘤效果。

4. GSTK1通过MQC调控L-肉碱代谢的关键转运蛋白

L-肉碱代谢依赖于肉碱转移系统（CPTS），包括CPT1、CPT2和肉碱/酰基肉碱转运蛋白（CACT），其内源性合成关键酶是γ-丁基甜菜碱羟化酶（BBOX）。研究发现，在Gstk1^△Hep小鼠和GSTK1敲低的肝癌细胞中，CPT2、CACT和BBOX的蛋白和mRNA水平下调，而CPT1A的表达则呈现异质性变化。鉴于L-肉碱代谢主要在线粒体进行，透射电镜观察发现，GSTK1过表达使线粒体形态变得更长、数量减少，而GSTK1敲低则导致线粒体碎片化、数量增多。分子水平上，GSTK1过表达促进了线粒体生物合成关键调控因子PGC1-α、线粒体融合蛋白MFN2以及线粒体自噬底物P62的表达，同时抑制了线粒体外膜蛋白TOMM20、磷酸化DRP1（Ser616）以及LC3II/I比值（线粒体自噬标志）。相反，GSTK1敲低则产生相反效应。这些结果说明GSTK1通过促进线粒体生物合成和融合、抑制线粒体分裂和自噬来正向调控MQC。使用线粒体分裂抑制剂Mdivi-1可以逆转GSTK1敲低导致的CPT2表达下降和L-肉碱水平降低，并能抑制GSTK1敲低细胞的增殖和迁移，证明MQC是GSTK1调控L-肉碱代谢和抑制肿瘤的关键环节。

5. GSTK1与DRP1竞争结合PGAM5

为了阐明GSTK1调控MQC的直接分子伙伴，研究人员通过免疫亲和纯结合LC-MS/MS分析，发现磷酸甘油酸变位酶5（PGAM5）是GSTK1的结合蛋白。Co-IP和免疫荧光实验证实了内源性GSTK1与PGAM5之间存在相互作用。进一步实验显示，GSTK1过表达会减弱PGAM5与DRP1之间的结合，而GSTK1敲低则增强两者的结合。通过蛋白质-配体相互作用预测器（PLIP）分析，预测出GSTK1的TYR-18等位点是其与PGAM5结合的关键位点。构建GSTK1的TYR-18点突变体后，发现其失去了与PGAM5结合的能力，同时也丧失了对线粒体分裂（p-DRP1 Ser616）和线粒体形态的调控作用。这表明GSTK1通过其TYR-18结构域与PGAM5结合，从而竞争性地抑制了PGAM5对DRP1的招募和激活，最终抑制了线粒体分裂。

6. GSTK1受PPARα/RXRα调控且RXRα激动剂Bexarotene可抑制HCC

通过生物信息学分析，研究人员推测过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）和视黄醇X受体α（RXRα）可能是GSTK1的上游转录调控因子。实验验证表明，使用RXRα激动剂（LG100064）或PPARα激动剂（Pirinixic Acid）处理能上调GSTK1的表达，而PPARα抑制剂（GW6471）或siRNA敲低RXRα则下调GSTK1表达。荧光素酶报告基因实验证实RXRα可直接作用于GSTK1的启动子区域。进一步研究发现，RXRα的高亲和力选择性激动剂Bexarotene能有效抑制肝癌细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡，且这种抑制作用在GSTK1高表达的细胞中更为显著。体内动物实验也证实，Bexarotene处理能抑制移植瘤的生长，且与GSTK1过表达具有协同效应。

7. HCC组织中GSTK1表达降低并与患者复发和预后相关

对临床肝癌样本的分析显示，与癌旁组织相比，肝癌组织中GSTK1的mRNA和蛋白表达水平均显著下调。免疫组化和免疫荧光染色显示，GSTK1低表达的肿瘤组织往往伴有较高的p-DRP1（Ser616）表达和较低的CPT2、CACT、BBOX表达，这与小鼠模型中的表型一致。利用公共数据库（GSE14520, HCCDB8）进行的生存分析表明，GSTK1低表达的HCC患者总生存期（OS）更短，肿瘤早期复发风险更高。GSTK1低表达还与高转移风险、晚期TNM/BCLC/CLIP分期以及高AFP水平相关。

结论与讨论

本研究首次系统地揭示了GSTK1在肝癌中作为一个重要的肿瘤抑制因子，其作用机制是通过与PGAM5结合，竞争性抑制PGAM5-DRP1复合物的形成，从而维持线粒体质量控制的稳态（促进生物合成/融合，抑制分裂/自噬），并正向调控L-肉碱代谢。这一机制的阐明，将线粒体质量控制与癌症代谢重编程紧密地联系起来，为理解肝癌的发病机制提供了新的视角。更重要的是，该研究不仅发现了GSTK1-PGAM5-DRP1这一新的调控轴，还验证了RXRα激动剂Bexarotene和L-肉碱补充剂在抑制肝癌中的潜在治疗价值，为肝癌的代谢靶向治疗提供了新的候选策略和联合用药思路。当然，本研究也存在一些局限性，例如未在基因敲除小鼠模型中全面评估L-肉碱的效应，以及尚未完全阐明阻断PGAM5对GSTK1功能的反馈影响。未来的研究可以围绕这些方面深入展开，以期将基础研究发现更快地转化为临床实践。总之，该研究深化了对肝癌代谢异常的认识，并提出了针对GSTK1及其相关通路进行干预的潜在新途径，具有重要的理论意义和潜在的临床应用前景。