利用多重抗性基因聚合与剂量增效策略创制马铃薯育种新种质

《American Journal of Potato Research》：Creation of Clones with Multiple Multiplexed Resistance Genes Useful in Potato Breeding

本研究针对马铃薯遗传基础狭窄问题，通过分子标记辅助选择将黄金线虫抗性基因H1、马铃薯Y病毒抗性基因Rychc和X病毒抗性基因Rx1进行基因聚合，并引入晚疫病抗性基因Rpi-blb3/R2。经过两轮剂量增效选育，获得34个多重抗性基因聚合材料，其中16个材料平均携带H1(3.00)、Rychc(2.56)和Rx1(2.81)基因，18个材料额外携带Rpi-blb3(0.83)和R2(0.61)基因，为马铃薯抗性育种提供了珍贵亲本资源。

　　

在马铃薯育种史上，1840年代的晚疫病大流行导致遗传多样性严重瓶颈，现代栽培品种仅源自少数祖先材料。日本育种基因库的遗传贫乏问题日益凸显，特别是黄金线虫(Globodera rostochiensis)和马铃薯Y病毒(PVY)的持续威胁，迫切需要拓宽遗传基础。安第斯栽培马铃薯(Solanum tuberosum ssp. andigena)作为重要的遗传资源库，其长日照适应性品系PGEL虽已开发，但存在块茎性状不佳、成熟晚等缺陷，限制了育种应用。

为突破这一困境，北海道农业研究中心团队开展了一项历时多年的系统工程。研究以95个长日照适应的PGEL杂交克隆为起点，通过多轮杂交与分子标记辅助选择，成功将H1（黄金线虫抗性）、Ry_chc（PVY极端抗性）和Rx1（PVX极端抗性）基因聚合到单个克隆中，同时引入墨西哥二倍体野生种S. pinnatisectum来源的Rpi-blb3和品种"Saya-akane"的R2晚疫病抗性基因。研究创新性地采用"基因聚合+剂量增效"策略：先通过多重PCR技术实现基因聚合，再通过实时荧光定量PCR指导两轮基因剂量提升。

关键技术方法包括：基于96孔深板的高通量DNA提取技术、可同步检测H1/Ry_chc/Rx1/R2的多重PCR体系、以腺嘌呤磷酸核糖转移酶(aprt)为内参的实时荧光定量PCR剂量分析技术。田间评价在北海道农业研究中心芽室分场进行，对超万株幼苗进行单株块茎性状筛选。供试材料涵盖安第斯栽培种、S. tarijense杂交种及日本主栽品种等多样化种质。

育种过程

研究分三阶段推进：基因聚合阶段通过1,217个杂交组合获得包含三种基础抗性基因的克隆，选择率34.7%（LBR-）和17.7%（LBR+）；首次剂量增效阶段使H1平均拷贝数从1.00升至2.35；二次剂量增效阶段进一步将LBR-材料的H1平均剂量提升至3.00。值得注意的是，携带晚疫病抗性基因的材料田间选择率（4.2-9.5%）显著低于不携带者（8.2-10.7%），暗示野生种源抗性基因可能连锁不利农艺性状。

多重剂量增效抗性基因克隆

最终获得的34个MMR克隆呈现丰富的遗传背景：20个具T型细胞质（主要来自Saya-akane），9个为P型细胞质（源于S. phureja），3个为A型细胞质，2个携带Alwara来源的W/γ型细胞质（导致四分体不育）。剂量验证实验显示，克隆22H114-25的H1基因型为AAAa（三显性），与实时PCR检测结果一致，其杂交后代抗性分离比符合染色体随机分离模型。

剂量变化

基因剂量增长规律显示：LBR-材料中H1/Ry_chc/Rx1每轮增效约0.89个拷贝，而LBR+材料中晚疫病抗性基因增长受限（Rpi-blb3从0.81增至0.83，R2从0.21增至0.61）。研究发现Rpi-blb3与R2均位于4号染色体晚疫病抗性基因簇，可能存在等位性互斥。

讨论

本研究通过分子标记技术高效创制了34个多重剂量增效抗性基因克隆，其中H1基因三显性组合可使后代抗性个体比例超过96%。然而，源自S. pinnatisectum（B基因组）的Rpi-blb3基因与栽培种基因组重组程度低，可能连锁导入不良农艺性状。研究还发现实时PCR对四显性基因型（AAAA）判定存在误差，22H104-1的剂量评分与后代分离比不符，提示技术精度需进一步提升。

这些MMR克隆作为PGEL种质的强化版本，虽未进行农艺性状量化测定和抗性生物验证，但其携带的多重抗性基因与多样化细胞质类型，为日本马铃薯育种提供了突破遗传瓶颈的关键亲本。特别值得注意的是，所有MMR克隆的H1/Ry_chc/Rx1基因均溯源至10H17，其染色体片段的多重重复可能产生类似近交的遗传效应，这对后代的影响仍需持续观察。